大型放射光施設 SPring-8

公開日

2002年08月16日

平成14年8月16日
理化学研究所

１．背景
　傷ついたDNAの修復は、細胞が正常に機能するために不可欠なメカニズムです。DNA修復機構が欠損すると、細胞のがん化や遺伝病につながることが知られています。今までの研究から、がんを頻発する遺伝病の原因遺伝子がDNA修復に深く関わっていることが明らかにされてきました。DNA修復機構は全ての生物が持ち合わせているものですが、特にヒトの場合、進化の過程で複数のDNA修復経路を獲得しており、それらはDNAが受けた損傷の種類によって役割分担をしていると考えられています。
　DNA損傷の中でも、DNAの二重鎖切断は、放射線や化学療法剤などの外的要因、または体内に生じた活性酸素やDNA複製のエラーなどの内的要因によってしばしば引き起こされます。このタイプのDNA損傷は、相同DNA組み換え^※１によって修復されます。相同DNA組み換えが欠損した細胞では、DNAの二重鎖切断が修復されずに蓄積し、染色体間での無秩序なDNA組み換えを誘発します。その結果、染色体異常がおこり、細胞はその秩序だった増殖調節能を失い、やがてがん化します。この相同DNA組み換え機構の中では、DNAの二重鎖切断部位と同じ塩基配列を無傷の染色体の中から見つけだして、二分子の染色体の間でDNAを組み換える「相同的対合反応（図１）」が非常に重要です。
　研究グループでは、相同的対合反応を行い、二重鎖DNA切断の修復の中核となるヒトRad52タンパク質に着目。相同的対合に関わるドメインの立体構造を決定し、立体構造に基づいた生化学的解析によってRad52による作用機構の解明を試みました。

２．研究の手法
　ヒトRad52遺伝子は、まず、全長である418アミノ酸からなるもの （Rad52 longer form：全長型Rad52）と、スプライシングバリアント^※２である約200アミノ酸からなるもの（Rad52 shorter form：短縮型Rad52）の２種類のタンパク質を産生しています。両者ともDNAに結合し、相同的対合反応を促しますが、それぞれの役割・構造などの詳細は明らかになっていませんでした。研究グループは、全長型Rad52の役割を明らかにすることを目的に、まず全長型Rad52をプロテアーゼで分解する「限定分解法^※３」によって、相同的対合反応を促す、独立したドメイン構造を見つけました。この領域は、Ｎ末端から約200アミノ酸までの領域であり、短縮型Rad52に対応します。次に、Rad52の1番目から212番目までのアミノ酸領域からなるRad52_1-212をデザインして単離・精製し、優れた単結晶を作製（図２）。大型放射光施設(SPring-8)の理研構造生物学Iビームライン（BL45XU）を用いて、多波長異常分散（MAD）法^※４で立体構造を決定しました。

３．立体構造の解析結果から明らかになったこと
　SPring-8からの高輝度なシンクロトロン放射光により、最終的には2.85 Å^※５の高分解能のＸ線解析データを得ることができました。これらのデータを解析し、得られた立体構造から、Rad52_1-212のDNA結合領域を推測することができました。さらに部位特異的にアミノ酸変異を導入する方法を用いて、DNA結合に重要なアミノ酸が領域内に存在することを証明しました。

１）「Rad52短縮型は11量体のリング構造を形成している」
　これまで、電子顕微鏡観察や生化学的解析などから、全長型Rad52は、7量体のリング構造を形成することが推定されていました。今回の結晶構造解析により、短縮型Rad52は、全長型とは異なり11量体のリング構造を形成することが分かりました。このように、同一遺伝子から作られる２つのタンパク質が、7量体と11量体という異なった会合体を形成する例はこれまでに報告されておらず、今回のケースが世界で最初の報告となります（図３）。

２）「Rad52リングの外周には、DNA結合を行うための溝が存在する」
　短縮型Rad52の11量体リング構造の表面電荷を解析した結果、リングの外周に塩基性アミノ酸が局在している溝が存在することが分かりました。DNAは酸性の物質であるため、この塩基性の溝がDNAとの結合部位であると予測されます。そこで、この塩基性の溝の中に側鎖を突き出しているアミノ酸を立体構造より同定し、部位特異的にアミノ酸変異を導入する方法によって、アミノ酸をアラニンに置換した変異体Rad52_1-212を１２種類作製しました。これらの変異体Rad52_1-212とDNAとの結合を生化学的に解析した結果、この塩基性の溝が単鎖DNAと二重鎖DNAの両方を結合し、両者の間で相同的対合反応を促すDNA結合部位であることが明らかになりました。また、この塩基性の溝の中に側鎖を突き出しているアミノ酸こそが、DNA結合に直接関係するアミノ酸であることが分かりました（図４）。

３）「7量体を形成するRad52全長型のリング構造のモデルを提案」
　決定した短縮型Rad52単量体の立体構造から、全長型Rad52の7量体形成モデルを構築しました。短縮型Rad52では、単量体当り３本のβシート構造が樽状につながって（βバレル構造）リング構造を形成していますが、全長型Rad52の7量体モデルでは、5本のβシートからなるβバレル構造によってリング構造が形成されると予測されます。また、全長型Rad52の7量体モデルにおいても、DNA結合溝は11量体と同様にリングの外周に位置しており、全長型Rad52と短縮型Rad52が同様のメカニズムで相同的対合反応を触媒することも推定されました。つまり、両者は、構造が異なるが、作用機構はほぼ一致していることを示唆しています（図５）。

４．今後の展開
　本成果によって、今までヴェールに包まれていたDNA組み換え修復の分子機構の一端が明らかになりました。また、ある種のがん細胞においてRad52における変異が見出されていることから、DNA組み換え修復欠損による発がんのメカニズムの解明に重要な知見を与え、さらにはRad52の機能不全を原因とする腫瘍形成に対する薬の創製にもつながると考えられます。またRad52は、生体内のDNA組み換えをつかさどる中核的タンパク質であることから、DNA組み換え技術として分子生物学的分野で応用できる可能性があります。将来的には、人工的にDNA組み換え反応を生体内で行う遺伝子治療や、家畜や作物の品種改良などへ応用することも可能になるなど、医学､産業の場面で基盤技術として活用されることが期待されます。

《参考資料》