大型放射光施設 SPring-8

公開日

2003年12月12日

平成15年12月12日
独立行政法人 科学技術振興機構

研究概要

　 人間をはじめとする高等生物は、栄養物を酸素（O₂）と反応させることによって、生存のために必要なエネルギーを獲得している（酸素呼吸）。この酸素呼吸のとき、チトクロム酸化酵素（注１）は、栄養物から引き抜かれてきた水素原子と酸素を反応させて、水を作る反応（O₂還元反応）を促進する触媒の役割をする。さらにこのチトクロム酸化酵素は、O₂還元反応で生成するエネルギーを利用して、正荷電をもつ水素イオン（H^＋、プロトンともいう）をこの酵素の一方から他方へ、水素イオン濃度勾配に逆らっても輸送する（能動輸送）機能をも持つ。このようにして正荷電を蓄積することは、生体内で電池を充電する（電位差を作る）ことにたとえられる。つまり、水素原子と酸素との反応によって得られたエネルギーは、生体内の電池の電位差に変換される（注２）。
　 これらのことは約四半世紀前に実験的に示されたが、その機構は全く不明であった。水素原子と酸素とがどのように反応して水になるのか、さらに疎水性のアミノ酸残基がつめ込まれているため、荷電をもったプロトンが透過することができないと考えられていたこの酵素（タンパク質）内部を、どのようにしてプロトンが能動輸送されるのか、さらにO₂還元反応によって得られたエネルギーが、どのようにしてプロトン能動輸送の駆動力になるのか。これらのことは生命科学研究のなかで最も基本的で、かつ最も興味深い課題であるため、多くの研究者がこれらの解明のために鎬を削ってきた。
　 プロトン能動輸送機構の解明のためには、O₂還元反応の進行に伴うチトクロム酸化酵素のタンパク質部分の立体構造変化をＸ線構造解析法によって検出する必要がある。そこで、吉川教授らのチームは、巨大な膜タンパク質複合体であるこの酵素の精製結晶化条件の最適化を長年にわたって研究してきた。さらに、大型放射光施設（SPring-8）に巨大分子結晶のＸ線構造解析用として設置された大阪大学蛋白質研究所の生体超分子複合体構造解析ビームラインBL44XUを利用して、1.8Å分解能でこの酵素の立体構造を決定した。この結果は、全く予想外の次のようなプロトン能動輸送機構を示していた。
　 水素原子とO₂との反応の際、水素原子はまず電子とプロトンに分離され、O₂はまず電子を受容してからプロトンを受け取り、２つの水分子になる。このとき電子は酵素分子内に固定されている銅イオンと、ヘムと呼ばれる鉄イオンを含む化合物を経由して、O₂が結合している部位に運ばれる。ヘムが電子を受け取ったときと、O₂結合部位へ電子を放出したときとで、ヘムの比較的近傍にあるアスパラギン酸をはじめとするいくつかのアミノ酸残基の立体構造が変化することが認められた。この構造変化と周辺のタンパク質の構造は、これがプロトンの能動輸送経路であることも明確に示していた。したがってO₂還元のために電子がヘムを通過するときに誘起される立体構造変化によって、プロトンが能動輸送される。このようにして、O₂還元がプロトン能動輸送を駆動することが明らかになった。
　 このようなX線構造解析結果を分子生物学的に検証するために、プロトン能動輸送経路の要であるアスパラギン酸（注３）残基を、プロトンを脱着する機能をもたないアスパラギン（注３）に置き換えたところ、水素イオン能動輸送能が全く失われた。さらに、ヘムが電子を受容しているか放出した後であるかによって、アスパラギン酸へのプロトンの脱着が制御されていることを、赤外分光法によって実証した。
　 生命科学分野では以前から、「基本的な生化学反応は全ての生物に共通である。」との強い先入観があり、「細菌で正しいことは象でも正しい。」と考えられている。吉川教授らは、上述のアスパラギン酸残基の立体構造変化を、より低い分解能のＸ線構造解析ではあるが、すでに1998年に発見した。しかし、植物や細菌の酵素の対応する位置に同じアミノ酸がないため、これがプロトン能動輸送部位であるとの主張はほとんど受け入れられなかった。
　 しかし今回の論文では、高分解能X線結晶構造解析、分子生物学的実験、赤外分光法と、３つの全く異なる方法で得られた実験結果によって、過去の吉川教授らの主張が改めて実証された形となった。

　 今回の研究対象であるチトクロム酸化酵素は代表的な膜タンパク質（水に不溶なタンパク質）である。現在使用されている医薬の70％の標的タンパク質が、膜タンパク質であることを考えると、膜タンパク質の基礎研究は、医学薬学の進歩に寄与するところ大である。
　 さらにチトクロム酸化酵素は水素原子を能動輸送する「プロトンポンプ」と見ることができる。生体には原理の異なる「プロトンポンプ」が存在するが、今回のメカニズムの解明が新たなプロトンポンプの解明の端緒となり、ひいてはナノ構造をもつ「生体ナノマシン」の解明、設計に役立つ可能性も無視できない。

（注１）：高等生物の細胞中のエネルギー工場といえるミトコンドリアの内膜に存在する３つの大きな呼吸酵素複合体の代表的なひとつ。約20万ダルトンの大きさで、ほとんどの水溶液に不溶な膜タンパク質。内部に鉄イオンと銅イオンをも含む。

（注２）：この電位差によってチトクロム酸化酵素とは別の酵素であるATP合成酵素がATPを作り、このATPが生命活動に必要なほとんどのエネルギー源として利用されている。

（注３）：アスパラギンもアスパラギン酸もタンパク質を構成するアミノ酸のひとつ。アスパラギンはアスパラギン酸のβカルボキシル基（COOH）がアミド(NH₂)化されたもの。

この研究テーマが推進された研究領域、研究期間は以下の通りである。
研究領域：生命活動のプログラム（研究総括：村松　正實　埼玉医科大学ゲノム医学研究センター所長）
研究期間：平成9年度～平成14年度

<補足説明>
本研究によって明らかにされたプロトン能動輸送機構の概略をFig.1とFig.2によって説明する。

１）ヘム周辺のＸ線構造
　Fig.1もFig.2も本文にあったヘム（鉄イオンを含む化合物）周辺の構造を示している。ヘムはheme a、中心に含まれている鉄イオンはFe_a、本文にあった要となるアミノ酸残基（アスパラギン酸）はD51と書かれている。oxidizedとreducedはそれぞれFe_aが電子を放出した状態と受容した状態とをしめす。D51(reduced) とD51(oxidized)はFe_aがそれぞれ電子を受容した状態の時のD51と電子を放出したときのD51の空間配置を示す。Reducedのときの構造は青く着色されている。その他の部分はoxidized/reducedによる変化を示さなかった。Fig.1Aは立体図で、右の図と左の図が重なるように左右の目の角度を調節すると立体的に見える。見やすくするために、この図の領域にある多くのアミノ酸が省略されている。青い小球は水分子の酸素原子の位置を示している。点線は水素結合と呼ばれる弱い化学結合である。プロトンはこの水素結合を経由して蛋白質内部を移動することができる。Fig.1Aの下から上へ水素結合を経由してプロトンが輸送される。D51(reduced)は図上方の分子表面に露出しているがD51(oxidized)は分子内部に埋没している。D51の水素結合状態のoxidized/reducedによる変化はFig.1Bに模式的に示されている。この分解能ではＸ線構造解析によって水素原子を検出することは不可能であるが、この水素結合状態に基づいて、reducedではCOO-、oxidizedではCOOHとなっていると結論できる。このプロトン化状態のoxidized/reducedによる変化は赤外分光法によっても確認されている。図に示されているとおり、水素結合のネットワークはD51からヘムのformyl group (-CHO)までつながっている。そこから下方はFig.2に示されている。Fig.2Aの赤はFe_a がoxidized青はFe_a がreducedのときの構造を示す。点で示された空間は複数個の水分子の入りうる空間である。鎖線は水分子がこの図の下方の分子表面（Fig.2Aには示されていない。Fig.2B模式図参照）から入り込むことのできる経路を示す。OxidizedからreducedにFe_aが変化したときに、いくつかのアミノ酸残基とヘムの側鎖のアルキル基との立体構造変化のため新しい水空間（青色点で示された空間）が生じる。Fig.2Bにはこのようなoxidized/reducedの変化によって誘起される水の入り込める空間の構造変化を模式的に示す。影をつけた部分が水分子の入り込める空間を示す。矩形の枠はFig.2Aで示されている領域を示す。青い楕円はreducedで生ずる水空間である。

２）プロトン能動輸送機構
　プロトンは水溶液中では必ず水分子に付加してヒドロニウムイオン(H₃O⁺)になっていることはよく知られている。この水分子の入りうる空間の容積の増加によって、H₃O⁺が下方分子表面から吸い込まれ、水素結合のネットワークの下端のformyl groupまで到達する。そこで水素結合のネットワークにプロトンが渡される。Fe_aがoxidizedになると水空間の容積が現象するため下方表面からプロトンを脱離した水分子は排出される。一方水素結合ネットワークに残されたプロトンは、Fe_aがoxidizedになるとヘム全体に生ずる正電荷による静電的反撥力によって、水素結合ネットワークを経由してD51まで運ばれる。そこでD51はプロトンをうけとり-COOHになり、reducedになったとき立体構造変化によって上方の分子表面に露出させられる。そこで脱プロトン化されるため上方分子表面からプロトンが放出される。以上のようにしてヘムのoxidized/reducedの変化に駆動されてプロトンが能動輸送される。

《参考資料》