プラスミドDNAの維持に関与する蛋白質複合体の構造を解析－バクテリアの細胞死を誘導する新規抗生物質の開発のターゲット－（プレスリリース）

公開日: 2005年08月19日

BL41XU（構造生物学I）

理化学研究所は、プラスミドDNAがバクテリアの中で安定に維持保守される機構に関与する蛋白質複合体の立体構造を決定し、その分子メカニズムを解明した。

平成17年8月19日
独立行政法人理化学研究所

本研究成果のポイント
・バクテリアのトキシンとアンチトキシンの複合体構造とトキシン蛋白質単独の立体構造の決定
・アンチトキシンによるトキシンの構造変化とそのRNA切断機構の解明
・院内感染原因菌に対抗する新たな抗生物質の開発が期待される

独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）は、プラスミドDNA^※１がバクテリアの中で安定に維持保守される機構に関与する蛋白質複合体の立体構造を決定し、その分子メカニズムを解明しました。理研中央研究所花岡細胞生理学研究室の花岡文雄主任研究員、鎌田勝彦先任研究員による研究成果です。
　院内感染菌などのバクテリアは様々な抗生物質耐性遺伝子を獲得したプラスミドDNAを保持しています。そのプラスミドDNAは、トキシンとアンチトキシンと呼ばれる二種類の蛋白質によって、バクテリアの中で維持保守されています。今回研究グループは、大腸菌宿主に存在するYoeBトキシン単独と、YoeBトキシンとYefMアンチトキシンの蛋白質複合体を結晶化し、放射光施設（Photon FactoryとSPring-8）のビームライン（SPring-8では構造生物学 I ビームラインBL41XU）を用いて、それらの立体構造を決定しました。その結果、YefMアンチトキシンの二量体構造が、RNA切断酵素であるYoeBトキシンの活性部位に立体構造変化を誘導することで、その活性を阻害することが分かりました。これらの構造情報に基づいた生化学的解析から、YoeBトキシンがどのようにしてRNA鎖の塩基を認識し切断するのかを明らかにすることが出来ました。
　アンチトキシンのトキシンへの結合を妨げることが出来れば、バクテリア自身の、またはそのプラスミドDNAが持っているトキシンのRNA切断活性を顕在化し、バクテリアの細胞死を誘導することが可能であると考えられます。院内感染菌が保持するプラスミドDNAの維持機構に着目した新規の抗生物質^※２の開発は、医療面で大いに貢献できると考えます。
　本研究成果は、米国の科学雑誌「Molecular Cell」(8月19日付）に掲載されます。

（論文）
"Conformational Change in the Catalytic Site of the Ribonuclease YoeB Toxin by YefM Antitoxin"
Katsuhiko Kamada and Fumio Hanaoka
Molecular Cell, Vol 19, 497-509, 19 August 2005

１．背　景
大腸菌などのバクテリアは小型の環状DNAであるプラスミドを保持しています。そのDNAが細胞分裂を通じて維持される仕組みがあり、トキシン（毒）とアンチトキシン（解毒剤）の二種類の蛋白質によって制御されます（図１）。まずバクテリアに入ったプラスミドはトキシンとアンチトキシン蛋白質を同時に供給します。これらは通常安定な複合体を形成し、トキシンの活性を抑えています。しかし、細胞分裂が進む過程で、プラスミドを保持しないバクテリアが生じると、不安定なアンチトキシンが宿主バクテリアの有する蛋白質分解酵素によって徐々に分解され、比較的安定なトキシンが活性化されて、生存に必要な機能を阻害して細胞死を誘導します。その結果、プラスミドを保持しているバクテリアだけが生き残っていきます。
　一部の腸球菌^※３では、様々な抗生物質耐性遺伝子を自身のプラスミドに取り込み、このような二種類の蛋白質を使って、そのプラスミドを維持し続ける戦略をとっています。このため、ほとんどの抗生物質が効かないバクテリアの繁殖が院内感染を引き起こし、社会問題となっています。アンチトキシン蛋白質の不安定性と、トキシン蛋白質のバクテリアへの毒性を分子構造的に理解することが、様々な抗生物質耐性遺伝子を持つプラスミドをコントロールすることにつながります。

２．研究手法と成果
　近年のバクテリアゲノムの研究から、バクテリア染色体にもトキシンとアンチトキシンの二種類の遺伝子セットがいくつも存在することが明らかになりました。我々は、大腸菌の遺伝子産物であるYoeB（トキシン）とYefM（アンチトキシン）の蛋白質複合体とYoeB蛋白質単独の結晶を作製し、Ｘ線結晶解析によって立体構造を決定しました。これらの蛋白質は、バンコマイシン耐性遺伝子だけでなく様々な抗生物質耐性遺伝子を持つ腸球菌のプラスミドのものとよく似ており、プラスミドDNAがコードするトキシン−アンチトキシンも同様な分子メカニズムで働いていると考えられます。
　構造解析の結果、YoeB-YefM複合体は1:2の組成で構成される三量体を形成していました（図２）。YoeBは RNA^※４を切断する酵素（リボヌクレアーゼ^※５）と似ていましたが、予測される活性部位の構造は大きく異なっていました。一方、YefMは以前に報告されたことのない新規の構造を取っていました。YefM二量体構造の一方の分子は片方を支えるのに徹し、支えられた方はその末端のペプチド鎖でYoeBを包み込むように結合するという、極めてユニークな複合体構造をしていました。
　様々な遺伝学的および生化学的実験結果から、YoeBには実際にリボヌクレアーゼ活性があり、グアニンとアデニン塩基の3’側を切断することが明らかとなりました。また、RNA切断に関与するYoeBのアミノ酸も特定することが出来ました。
　さらにYoeB単独の構造解析の結果、YoeBの活性部位の構造はバクテリアの分泌型リボヌクレアーゼSaなどに見られる典型的なコンフォメーションを有していたことから、YefMはYoeBの活性部位の構造を積極的に変化させることで、そのリボヌクレアーゼ活性を阻害していることが分かりました（図３AとB）。これらの構造的情報に基づいて、YoeBがどのようにグアニンとアデニン塩基を認識してRNA鎖を切断するのかを理解することが出来ました（図３C）。

３．今後の期待
　このようなトキシンとアンチトキシン蛋白質を用いた制御系は、抗生物質の耐性遺伝子を獲得したバクテリアだけを選択的に生き残らせるように働いています。構造的にトキシンとアンチトキシン複合体の形成を阻害することで、トキシンのRNA切断活性を上昇させ、バクテリア自身の細胞死を誘導出来ると考えられます（図４）。特に、アンチトキシンに注目した新しい概念の抗生物質の開発は、感染菌治療への利用が大いに期待出来ると考えています。

<参考資料>