大型放射光施設 SPring-8

公開日

2010年09月30日

2010年9月30日
独立行政法人理化学研究所
国立大学法人東京大学大学院理学系研究科

本研究成果のポイント
○ グルタミンの付加されたtRNAを生成する巨大複合体の立体構造解析に成功
○ 第1の酵素が誤ったアミノ酸をtRNAに付加する瞬間を初めてとらえる
○ 誤りを速やかに修正するために第2の酵素がすぐそばで待機していることを発見

1．背　景
　遺伝情報に基づいて作られるタンパク質の生成は、生命の根幹をなす重要な反応です。DNAに書き込まれている遺伝情報は、まず伝令RNA（mRNA）へと転写されます。mRNA中の3文字の核酸配列（コドン）は、リボソーム上で1つのアミノ酸へと変換され、アミノ酸の連なったタンパク質が合成されます。mRNA中のコドンと1つのアミノ酸を対応させている分子がtRNAです。20種類のアミノ酸には、それぞれに対応するtRNAが存在します。ヒトを含む真核生物と一部の細菌では、アミノ酸ごとに対応する20種類のアミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）が存在し、対応するtRNAにアミノ酸を正確に付加することで、正しいペア（アミノアシルtRNA）を生成します。この機構によって遺伝情報に対応した正確なタンパク質合成が保障されています。

　しかし、多くの真正細菌、古細菌では、20種類のaaRSのうち、アミノ酸の一種であるグルタミン（Gln）をtRNA^Glnに付加するaaRS（GlnRS）が存在しません。代わりに、グルタミン酸（Glu：Glnのアミノ基（-NH₂）がヒドロキシル基（-OH）となっている）を材料とした2段階の反応でGlnが付加されたtRNA^Gln（Gln-tRNA^Gln）を作ります。そのような生物では、まず、Gluに対応するaaRS（GluRS）の働きが拡張されてtRNA^GluにもtRNA^Glnにも区別せずに働き（非識別型GluRS）、tRNA^Glnにとっては「誤った」アミノ酸であるGluを付加して、Glu-tRNA^Glnという誤ったペアを中間体として生成します。次に、GatCABというアミド基転移酵素^※5が、tRNA^Gln上でGluのヒドロキシル基をアミノ基へと変換することによってGluをGlnへと修正し、正しいペアであるGln-tRNA^Glnを最終産物として生成します。これは、わざと間違えて修正するというユニークなメカニズムです。

　一方で、この方式は、GatCABが、tRNA^Glnにのみ働き、tRNA^Gluには働かないことが必要であり、もしもGatCABの働きに過不足があると、生物は2重のリスクを抱えることになります。1つは、中間体のGlu-tRNA^Glnがリボソームへと運搬されることで、Glnの位置にGluが導入されて誤ったタンパク質を合成してしまうことです（1）。もう１つは、GatCABが間違えてGlu-tRNA^Gluに作用することで、Glu-tRNA^GluのGluがGlnに変換され、Gln-tRNA^Gluができ、逆にGluの位置にGlnが導入されてしまうことです（2）。GluはGlnとは異なり、マイナスの電荷を持ち、両者はタンパク質中でまったく違う役割を持つため、でき上がった異常なタンパク質が生物にとって致命的な事態を招くことになりかねません。生物が、このようなリスクを冒してまでGlnを利用しようとするほど、アミノ酸の１つ１つは大切な役割を持っていて、その利用にはリスクを回避する巧みなリスク管理のメカニズムが必要となります。

　また、中間体のGlu-tRNA^Glnは、生体内では不安定であることが知られており、GatCABによる修正は迅速に行われなければなりません。緩慢な修正をしていては、中間体が分解され、エネルギーを浪費することになります。従って、正しいペアであるGln-tRNA^Glnが生成される過程には、何らかの特別な仕組みが存在することが予想されていましたが、具体的な証拠はありませんでした。

　今回、研究グループはtRNA^Glnとそれに働く2種類の酵素GluRS、GatCABを用いて、Gln-tRNA^Glnの生合成メカニズムの解明に挑みました。

2．研究手法と成果
　研究グループは、真正細菌（Thermotoga maritima：サーモトーガ・マリティマ）由来のtRNA^GlnとGluRS、GatCABを用い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動^※6により、それらの結合状態を解析する実験を行いました。その結果、3者が安定した巨大な複合体を形成することを発見し、これを『グルタミン・トランスアミドソーム』と命名しました。

　次に、グルタミン・トランスアミドソーム（以下、トランスアミドソーム）の3次元（3D）構造を明らかにするために、X線結晶構造解析に適した結晶を作製することに成功し、大型放射光施設のSPring-8^※7の構造生物学IビームラインBL41XUと高エネルギー加速器研究機構（KEK）のPhoton FactoryでX線回折実験を行い、トランスアミドソームの3D構造を解明しました。

　トランスアミドソームの3D構造から、実際にGluRSとGatCABがtRNA^Glnに対して同時に結合し、トランスアミドソームを構築している様子を詳細に明らかにすることができました（図1）。また、この3D構造では、GluRSがtRNA^Glnと相互作用し、「誤ったアミノ酸」であるGluをtRNA^Glnに付加しようとしている瞬間、つまり、放置すれば、中間体のtRNA^Glnがリボソームへと運搬されてしまうリスク（1）を冒している瞬間を初めてとらえることに成功しました。この相互作用様式から、非識別型GluRSが、本来の基質ではないtRNA^Glnを、本来の基質であるtRNA^Gluと同じように認識してアミノアシル化できる仕組みが明らかになりました。

　一方、トランスアミドソーム中のGatCABは、そのテールボディ^※8が、tRNA^GlnのL字型の外側のDループと呼ばれる部分の構造の違いを手がかりに、Glu-tRNA^GlnとGlu-tRNA^Gluとを見分けていることを発見しました。また、テールボディ以外の触媒ボディ^※8は、tRNA^Glnに働きかけるために接してはいませんでしたが、その一部がGluRSと相互作用し、「留め金」がかかったように固定されていました。すなわち、今回とらえたトランスアミドソームのGatCABは、GluRSがtRNA^GlnにGluを付加しようとしているときに、GluRSから中間体のGlu-tRNA^Glnを受け渡されるのを待ち構えている状態であることが分かりました。これらの結果は、GatCABが、同じGluRSの作り出すGlu-tRNA^GlnおよびGlu-tRNA^Gluのうち、Glu-tRNA^Glnを、Gln-tRNA^Glnへと確実に修正する一方で、働いてはいけないGlu-tRNA^Gluは修正しないように管理していることを示しています。こうして、中間体のGlu-tRNA^Glnがリボソームへと運搬されてしまうリスク（1）とGatCABが作用すべきGlu-tRNA^GlnをGlu-tRNA^Gluと間違えるリスク（2）の2重のリスクを回避する巧妙な仕組みを明らかにしました。

　GluRSの反応が完了した後にGlnへと修正されるべきGluは、tRNA^Glnの末端部分に付加されていますが、どのようにしてGatCABがその末端部分を受け取るのでしょうか。GatCABとGluRSの構造情報を詳しく調べると、GatCABとGluRSのそれぞれに、蝶番（ちょうつがい）のような構造を見いだしました。すなわち、GatCABとGluRSは、蝶番で曲がることによって、tRNA^Glnに結合したまま（トランスアミドソームを形成したまま）で、触媒ボディを動かすことができ、Glu-tRNA^Glnの末端部分から遠ざけたり、近づけて働かせたりすることができるという予想外のメカニズムの存在を発見しました（図2）。これにより、素早く確実な修正が可能になっていると考えられます。

　これまでのGluRS、tRNA^Gln、GatCABに関する立体構造研究から、1分子のtRNA^Glnの末端部分に対して、GluRSとGatCABが同時に結合しようとすると互いに衝突してしまうことが分かっていました。そのため、GluRSがtRNA^Glnから離れた後でGatCABが結合すると考えられており、「トランスアミドソーム」のような3者複合体が継続的に形成されることはないと思われていました。しかし実際には、GluRSとGatCABの蝶番構造により、互いに協調し合うことでトランスアミドソームの形成が可能であり、今まで機能不明だった部分構造は、「留め金」としてトランスアミドソームを安定化していることが分かりました。

　これらをまとめると、GatCABはGluRSおよびtRNA^Glnとトランスアミドソームを形成することによって、リスクを管理し、巧妙にGln-tRNA^Glnを作りだします。まず、GluRSがtRNA^Glnに「誤った」アミノ酸であるGluを付加しているときには、GatCABがすぐそばで待機していて、確実に修正できるようにすることにより、Glu-tRNA^Glnを間違って手放してしまうリスクを回避しています。GluRSは、中間体のGlu-tRNA^Glnを生成すると、自分の触媒ボディを素早く移動させ、グルタミン酸の付加されたtRNAの末端部分から離れます。続いて、待機しているGatCABがその触媒ボディをさらに近づけて、tRNAの末端部分を受け取り、GluをGlnへと修正します。一方、GluRSが本来の基質であるtRNA^Gluに「正しい」アミノ酸であるGluを付加しているときには、GatCABは結合せず（トランスアミドソームを形成せず）、過剰な間違った修正を起こすリスクも回避していました。こうして、正しいペアであるGln-tRNA^Glnを生成するための、このような巧妙なメカニズムの存在を初めて明らかにすることができました（図3）。

3．今後の期待
　今回の研究では、Gln-tRNA^Glnという正しいペアが生成される過程で中心的な役割を果たすトランスアミドソームが存在することを発見し、その立体構造を明らかにしました。また、トランスアミドソームに含まれる2種類の酵素（GluRSとGatCAB）は、互いに協調するための構造変化が可能な設計になっており、酵素間でのダイナミックな基質tRNA^Glnの受け渡し機構を明らかにすることができました。この発見は、基質となる1つの生体高分子に連続反応を担う2つの酵素が同時に結合して連携する状態の立体構造を初めて明らかにしたという点でも大きな意義があり、今後の多くの研究の基礎となります。

　このような複雑なメカニズムを用い、「2重のリスク」を冒してまで、グルタミンというアミノ酸をタンパク質に組み込む必要があることは、タンパク質の機能を発揮するために、アミノ酸の種類にさまざまなバラエティーがあることの重要性を強く示しています。グルタミンは、生命の進化において比較的新しくタンパク質合成に用いられるようになったアミノ酸であると考えられており、生命が新たなアミノ酸をタンパク質の構成成分として獲得したメカニズムを検証するための基盤となります。グルタミン以外にも、特殊な元素であるセレンを含むアミノ酸（セレノシステイン）の生合成^※9を行う際に、「誤ったアミノ酸をわざと付加してから修正する」という「2重のリスクを冒す」という戦略がとられており、各段階の酵素反応の仕組みは明らかになりつつあります。しかし、複数の酵素が連携して働く仕組みはまったく明らかにはなっていません。そのような研究にも、今回の研究成果が基礎として大きく役立つと期待されます。

　また今回、進化の過程で生物が必要に応じて利用可能なアミノ酸の種類を増やしていくメカニズムの一端を解明したことで、工学的な応用ができるようになります。すなわち、タンパク質の生合成においてさまざまなアミノ酸を利用可能にすることによって、新しい機能を担うタンパク質を創製する基盤技術開発や、それらを通じた新しいタンパク質医薬などの有用タンパク質の開発にもつながると期待できます。現在は、利用したい有用アミノ酸を直接tRNAに結合させる新たな特異性を持つaaRSを作りだすタンパク質工学的な研究開発が行われていますが、今後は、「誤ったアミノ酸を付加してから修正する」という戦略をとった研究開発が行われることが考えられます。

　また、GatCABと「非識別型」のGluRSは、ピロリ菌などの病原菌の増殖に欠かせない酵素で、ヒトなどの真核生物には存在しないことから、それらをターゲットとする新たな作用機構の抗菌剤開発への応用が期待されます。

《参考資料》

《用語解説》
※1　転移RNA（tRNA）
　転移リボ核酸の略号。DNAから転写されて生成したmRNAには、塩基配列であるアデニン （A）、グアニン　（G）、シトシン（C）、ウラシル（U）のうち3つが1組（コドン）となって1つのアミノ酸がコードされている。コドンとアミノ酸を対応付けるアダプター分子がtRNAである。tRNAはL字型の立体構造をしており、L字の角の外側の部分はDループおよびTループと呼ばれる領域が形作っている。L字型の一番先にはコドンと塩基対合することができるアンチコドンが存在し、反対側の先に位置するA76リボースに、対応するアミノ酸が付加された後に、リボソームに運ばれる。mRNAのコドンとtRNAのアンチコドンがリボソーム上で対合すると、tRNAに結合していたアミノ酸同士が次々とつながり、タンパク質が合成される。また、20種類のアミノ酸には、それぞれに対応するtRNAが存在する。ここでは、例えば、グルタミン（Gln）に対応するtRNAは、tRNA^Glnと記した。

※2　アミノアシルtRNA合成酵素 (aaRS)
　タンパク質を構成するアミノ酸は主に20種類存在する。20種類のアミノ酸のそれぞれに対してアミノアシルtRNA合成酵素が20種類存在し（アスパラギン酸に対応するAspRS、リシンに対応するLysRSなど）、ATPのエネルギーを利用してアミノ酸を活性化したのち、対応するtRNAのCCA末端に付加する（アミノアシル化）。

※3　真正細菌、古細菌
　すべての生物は真核生物、古細菌、真正細菌の3つのグループに分類される。真核生物の特徴は細胞内に核を持ち、細胞のそれ以外の部分からは膜で仕切られていることである。核の中には遺伝情報が書き込まれたDNAが収められている。一方、核を持たない生物は、古細菌と真正細菌とに分類され、地球上のあらゆる環境に生息しており、その代謝系は多種多様である。古細菌は、その遺伝情報が真正細菌よりも真核生物に近いといった特徴を持ち、極限環境に生息しているものが多い。真正細菌とはいわゆる細菌（バクテリア）のことで、大腸菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ菌、コレラ菌、赤痢菌などを含む。

※4　GatCAB
　GatはGlutamyl-tRNA amidotransferase（グルタミル‐tRNAアミド基転移酵素）の略号。GatCおよびGatA, GatBという３つのタンパク質からなるヘテロ3量体であり、GatAはドナーとなる分子からアンモニアを引き抜く活性を、GatBはGatAによって生成したアンモニアとATPを用いてtRNA上のグルタミン酸をグルタミンへと変換する活性を持つ。GatAとGatBはGatCと共に複合体を形成しており、アンモニアを通すためにGatAの活性部位とGatBの活性部位との間にトンネルが存在する。

※5　アミド基転移酵素
　基質のカルボキシル基にアミノ基を転移し、アミド基を生成する反応を触媒する酵素。GatCABの場合には、グルタミン酸側鎖のカルボシキル基をアミド基へと変換し、結果としてグルタミン酸をグルタミンへと変換する。

※6　ポリアクリルアミドゲル電気泳動
　アクリルアミドの重合体であるポリアクリルアミド中で、核酸やタンパク質などを電気泳動し、それらを分離する方法。

※7　大型放射光施設SPring-8
　兵庫県の播磨科学公園都市にある世界最高の放射光を生み出す理化学研究所の施設。SPring-8の名前はSuper Photon ring-8GeVに由来する。放射光とは、電子を光とほぼ等しい速度まで加速し、電磁石によって進行方向を曲げた時に発生する、絞られた強力な電磁波のこと。SPring-8では、この放射光を用いて、ナノテクノロジー、バイオテクノロジーや産業利用まで幅広い研究を行っている。

※8　テールボディと触媒ボディ
　GatBに存在する2つの蝶番により、GatCABは3つのまとまった領域に分けられる。そのうちtRNAのL字の角の部分を認識しているGatBのヘリカルドメインとテールドメインの2つの領域をあわせてテールボディと命名し、GatCABのそれ以外の部分を触媒ボディと命名した（図1参照）。

※9　セレンを含むアミノ酸（セレノシステイン）の生合成
　21番目のアミノ酸として知られるセレノシステイン（Sec）の生合成経路においても、誤ったアミノ酸をわざと付加してから修正するという戦略がとられている。すなわち、セレノシステインに対応するtRNA（tRNA^Sec）に、まず誤ったアミノ酸であるセリンが付加され、さらにtRNA^Sec上でセリン部分がリン酸化され、最後にセレンを受け取り最終産物であるSec-tRNA^Secができ上がる（2010年8月13日プレス発表： http://www.riken.go.jp/r-world/info/release/press/2010/100813/detail.html）。