大型放射光施設 SPring-8

公開日

2011年03月02日

2011年3月2日
独立行政法人　理化学研究所

本研究成果のポイント
○ ヒト由来膜タンパク質を用いて世界最高水準の1.9 Å分解能で構造を解析
○ ロイコトリエンC₄合成酵素は、2つのアルギニン残基が協調して機能
○ ロイコトリエンC₄合成酵素（LTC₄S）機能を原子レベルで初解析

1．背景
　生体防御の一環として働く炎症反応や免疫反応では、免疫系細胞である肥満細胞が重要な役割を担っています。肥満細胞が異物を認識すると、システイニルロイコトリエン（Cys-LT）を含むさまざまな情報伝達物質を放出します。細胞から放出されたCys-LTは、周辺の細胞の表面にある特異的な受容体タンパク質に結合して、平滑筋の収縮、粘液の分泌促進、毛細血管の透過性亢進などを誘導し、異物の排除に重要な炎症反応や免疫反応を開始させます。例えば風邪を引いた時の鼻水・鼻づまりなどは、このような生体防御反応の表れです。一方、過剰な生体防御反応は、逆に命を危険にさらす場合があります。蜂に刺された時に、呼吸不全や血圧低下が起こるアナフィラキシーショックなどが典型的な例です。また、Cys-LTの受容体タンパク質への結合を妨げる薬剤が、花粉症や気管支喘息の治療で有効であることが示すように、Cys-LTは、花粉症や気管支喘息の症状の発症に関わっています。Cys-LT代謝に関わるタンパク質の構造と機能の研究は、花粉症や気管支喘息発作を含めた生体防御反応を原子レベルで理解し、制御する方法の研究に不可欠です。
　生体内でCys-LT産生の鍵となるタンパク質は、ロイコトリエンC₄合成酵素（LTC₄S）と呼ばれる膜タンパク質です。LTC₄Sは、脂肪酸の一種であるロイコトリエンA₄ （LTA₄）に、生体内の還元物質であるグルタチオン（GSH）を結合してロイコトリエンC₄（LTC₄）を合成します。Cys-LTは、このLTC₄と、細胞外のペプチド分解酵素によってLTC₄から作られるLTD₄とLTE₄の総称です。これは、LTC₄、LTD₄、LTE₄のいずれも、分子内にGSH由来のシステイン残基を含むためです。研究グループは2007年に、LTC₄Sの結晶構造解析に成功し、2つのLTC₄S分子の間に作られるV字型の空間が、LTC₄合成の活性部位であることなどを明らかにしましたが（2007年7月16日プレスリリース）、GSHとLTA₄の結合を促進するアミノ酸残基を確定するには至っていませんでした。

2．研究手法
（１）LTC₄Sの結晶構造解析
　LTC₄Sの活性部位の構造をより精密に検討するため、大型放射光施設SPring-8の理研構造ゲノムビームライン（BL26B2）と理研構造生物学Ⅱビームライン（BL44B2：現在は理研物質科学ビームラインと改称）を使って、LTC₄Sの結晶構造を分解能1.9 Å（オングストローム＝10^-10m）の精度で決定しました（図1）。1.9 Å分解能は、ヒト由来膜タンパク質の結晶構造解析の精度として、現在の世界最高水準です。
（2）LTC₄Sのアミノ酸置換体の酵素活性の解析
　精度良く決定したLTC₄Sの結晶構造の検討から、活性部位を挟んで、その両側に存在する2つのアルギニン残基が、LTA₄ とGSHの反応性を高める触媒残基として機能する反応機構が予想されました。これを検証するため、活性部位周辺のアルギニン残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体LTC₄Sの生化学実験を行いました。

3．研究成果
　結晶構造解析の結果、150個のアミノ酸からできているLTC₄S中の、31番目と104番目のアルギニン残基が、それぞれLTA₄とGSHに作用し、LTA₄とGSHの間の結合形成を促進している反応機構が予想されました。LTA₄とGSHの間に結合を作るためには、マイナスの電荷を帯びて反応性が高まったGSHの硫黄（S）が、LTA₄のエポキシ基^※2が結合した炭素（C）を、定められた方向から立体特異的に攻撃することが必要です（図2）。 通常生体内の GSH の硫黄は、水素（H）を１つ持ち、電気的に中性であるため反応性が低く、エポキシ基を攻撃することができません。しかし、LTC₄Sの結晶構造解析結果は、104番目のアルギニン残基（Arg104）とGSHの硫黄の間の距離が3.2 Åで、アルギニン残基が硫黄から水素イオン（H^＋）を奪い、GSHの硫黄がマイナスの電荷を帯びることで、反応を促進している可能性を示しました。この可能性を検証するため、Arg104を、水素イオンを奪う能力が無いアラニン残基やグルタミン残基で置換した変異体LTC₄Sを作り、その酵素活性を測定しました。その結果、生体内の環境に近い中性の水溶液中では、変異体LTC₄Sの酵素活性は天然型LTC₄Sの酵素活性の2％程度と、非常に弱い活性しか示さないことが分かりました（図3）。この結果は、Arg104が、GSHから水素イオンを奪い反応を促進する「塩基触媒残基」であることを示しています。
　活性化したGSHの硫黄の攻撃に伴って、LTA₄のエポキシ基は次第にマイナスの電荷を帯び、そのままでは反応が妨げられてしまいます。結晶構造を使ったLTA₄結合モデルの観察から、31番目のアルギニン残基（Arg31）が、水素イオンをエポキシ基に与え、反応の進行に伴ってエポキシ基が帯びるマイナスの電荷を中和することで、反応を促進している可能性を推察することができました（図1）。この可能性を検証するため、Arg31をほかのアミノ酸残基で置換した変異体LTC₄Sを作り、その酵素活性を測定しました。水素イオンをエポキシ基に与える能力が無く、エポキシ基のマイナスの電荷を中和できないアラニン残基、グルタミン酸残基、ロイシン残基に置換した変異体LTC₄Sの酵素活性は、Arg31を持つ天然型LTC₄Sの酵素活性の数％程度と非常に弱くなりました。一方、部分的に中和できるグルタミン残基に置換した変異体LTC₄Sでは、天然型LTC₄Sの30％ほどの酵素活性を維持していました（図3）。すなわち、Arg31の位置にあるアミノ酸残基が、エポキシ基のマイナスの電荷を中和することができる場合は、LTC₄を効率良く合成できることが分かりました。この結果は、Arg31が水素イオンをエポキシ基に与え、エポキシ基が帯びるマイナス荷電を中和して、反応を促進する「酸触媒残基」であることを示しています。
　これらの結果から、LTC₄Sの2つのアルギニン残基が、一方はGSH専用の塩基触媒残基として、もう一方はLTA₄専用の酸触媒残基として、協調して機能する LTC₄産生の触媒残基であることが判明しました。

4．今後の期待
　研究グループは今回、LTA₄ とGSHからLTC₄を合成する酵素として機能する、LTC₄Sのアミノ酸残基を明らかにしました。LTC₄Sの酵素としての機能の全貌を理解するためには、LTC₄Sのさらなる研究が必要となります。例えば、現在解析できているGSHを結合したLTC₄Sの結晶構造では、GSHはLTC₄Sの活性部位の奥深くに埋め込まれているため、そのままの構造では、合成したLTC₄がLTC₄Sから離れることができず、新しくGSHがLTC₄Sの活性部位に近づくこともできません。GSHの取り込みと生成物LTC₄の放出に伴うLTC₄Sの大きな構造変化が予想され、LTC₄Sの機能の全貌の理解には、LTC₄Sの立体構造がどう動いて変化するかを知る必要があります。
　今回の研究で、Cys-LT産生の中心的触媒反応を明らかにすることができ、複雑なCys-LT産生の全貌理解に一歩踏み込んだことになりました。さらに、Cys-LTが関与する花粉症や気管支喘息発作を含めた生体防御反応の理解が進むと、これを制御する創薬の研究へとつながると期待できます。

《補足説明》
※1　大型放射光施設（SPring-8）
兵庫県の播磨科学公園都市にある世界最高の放射光を生み出す理化学研究所の施設。放射光とは、光速に近い速度で加速した電子の進行方向を電磁石で変えたときに発生する、強力な電磁波（X線）のこと。SPring-8の名前はSuper Photon ring-8GeVに由来する。SPring-8では、この放射光を用いて、ナノテクノロジー、バイオテクノロジーや産業利用まで幅広い研究が行われている。

※2　エポキシ基
炭素2つと酸素1つで作られた3員環エーテルをエポキシ基という。エポキシ基の3員環はひずみが大きく開裂しやすいため反応性に富み、さまざまな化学合成の中間体として用いられている。一般的には酸触媒で3員環が開裂し、反応が進行する。また通常のエーテルと異なり、塩基触媒でも反応が始まる。エポキシ基を持つLTA₄は、細胞膜に由来する脂肪酸であるアラキドン酸に5-リポキシゲナーゼが酸素を付加し、生合成される。