大型放射光施設 SPring-8

公開日

2011年05月12日

平成23年5月12日
東京大学
京都産業大学
京都大学

発表内容
　すべての細胞には、新しく合成された蛋白質が、合成の場である細胞質からその蛋白質が実際に働く場所へと生体膜を超えて分泌輸送される仕組みが備わっています。通常はイオンすら通さない生体膜が蛋白質という巨大な分子を透過させることができるのは、生体膜に蛋白質を膜透過させるための専用のチャネル(Secトランスロコン)が存在しているからです。蛋白質の輸送の仕組みについては、後にノーベル賞の受賞に結びついた、1975年にブローベルらが発表した「シグナル仮説」^(注１)をはじめ、現在に至るまで数多くの研究結果が発表されています。原核生物におけるSecトランスロコンはSecYEGと呼ばれる膜蛋白質の複合体であり、Secトランスロコンを介した蛋白質の分泌は膜に局在するモーター蛋白質SecA によって駆動されています(図1A)。この時ATPがエネルギーとして使われますが、蛋白質の分泌がプロトン駆動力(PMF)^(注２)によっても促進されることは謎でした。本研究では、真正細菌や古細菌で蛋白質の分泌に関わることが知られていたSecDFという膜蛋白質に着目しました。SecDFはSecYEGと複合体を形成し蛋白質の膜透過を高効率化していると考えられていましたが、実際にどのような働きをしているのかはほとんどわかっていませんでした。その原因としてSecDFが水に溶けにくい膜蛋白質であり取扱が困難であったことや、SecDFの働きを細胞の形が失われた試験管内反応で解析することが困難であったこと等があげられます。今回の発表は、本研究グループの７年間にわたるSecDF研究が実を結んだものです。まずSecDFを安定かつ大量に精製する方法を確立し、結晶化に成功しました。続いて、大型放射光施設SPring-8^(注３)の構造生物学Iビームライン（BL41XU）を利用したX線結晶構造解析^(注４)によってSecDFの構造を高分解能で決定しました。さらに、得られた立体構造から予測されるSecDFの機能部位を改変する一連の解析からSecDFの働きを初めて明らかにしました。

　SecDFの結晶構造から、SecDFは疑似２回対象に配置した12本のα-ヘリックスからなる膜貫通領域と２つの細胞外(ペリプラズム)領域(以下P1、P4と略します)から構成されることがわかりました(図1B)。P1領域は２つの構造単位、ヘッド領域とベース領域からなります。SecDFのP1領域はダイナミックな構造変化を起こし、ヘッド領域の配向が異なったF型とI型の２つの形をとります(図2)。また、SecDFの膜貫通領域はPMFを利用した薬剤排出トランスポーターAcrB^(注５)の膜貫通領域と類似の構造をとることがわかり、SecDFも水素イオンを利用することが考えられました。in vitro^(注6)における蛋白質の膜透過反応を調べることによって、ATPとSecA が必要とされる膜透過を開始するステップと、その後ATPがなくても進行する蛋白質膜透過の後期・完了ステップとに分けて解析することができます。この実験によりSecDFとPMFはこのATPに依存しない後期ステップに必要であることが突きとめられました。海洋性細菌由来のSecDFは、水素イオンの代わりにナトリウムイオンを利用して蛋白質膜透過を促進していることも明らかとされました。パッチクランプ法^(注7)による電気生理学的解析とSecDFの変異体解析^(注8)によって、SecDFの膜貫通領域にはプロトンの通り道が存在することがわかり、この膜貫通領域の中心部に存在する進化的に保存されたアスパラギン酸残基、アルギニン残基(図3)が、プロトンの透過とSecDFの働きの両方に必須であることが証明されました。一方、膜から突出したP1領域は、膜透過途上にある分泌蛋白質など安定な構造をとっていない蛋白質と結合する性質があることがわかりました。P1領域の変異体解析から図2に示したP1領域の構造変化が実際に生体内で起こり、この構造変化が蛋白質の膜透過反応に重要であることを示しました。以上の結果から、図4に示したように「SecDFは水素（陽）イオンの細胞内への流入を利用して大きな構造変化を繰り返しながら、ペリプラズム側で膜透過基質蛋白質と相互作用し、膜透過の高効率化に寄与する膜内在性シャペロンである」との結論を得ました。

　本研究では、蛋白質の膜透過に関わるSec蛋白質群のなかで唯一構造の報告がされていなかったSecDFの構造を明らかとし、その機能の詳細を解明しました。今後、本研究成果によって図1に示したSecトランスロコン複合体の立体構造と機能解析の研究が大きく進展することが期待されます。そして、膜を隔てた物質輸送の研究分野一般にも大きな影響を与えることが期待されます。また近年多剤耐性遺伝子を持つ病原菌が問題となっていますが、これらの菌体はSecDFを持つため、SecDFの細胞外領域を標的とする新しいタイプの抗生物質の発見につながるなど、基礎科学だけでなく医学への応用も期待されます。

　本研究成果は、文部科学省科学研究費補助金[特定領域研究(22020008、 22020035)、新学術領域研究(22121503)]、日本学術振興会科学研究費補助金[基盤（S）(20227003)、 基盤（A）(20247020)、 基盤（B）(22370070)、 若手研究B(21770135)]、 ターゲットタンパク研究プログラム、 科学技術振興機構バイオインフォマティクス推進センター (BIRD)などの支援を受けました。

発表雑誌
タイトル：Structure and function of a membrane component SecDF that enhances protein export
（蛋白質の膜透過を促進する膜蛋白質SecDFの構造と機能）
著者：塚崎智也*、 森博幸*、越前友香、石谷隆一郎、深井周也、田中剛史、Perederina Anna、 Vassylyev Dmitry G.、河野俊之、Maturana Andrés D.、 伊藤維昭**、濡木理**（*同等貢献、**責任著者）
英国科学誌「Nature」オンライン版に2011年5月12日2時(日本時間)付けで公開。

《参考資料》

《用語解説》
注1 シグナル仮説
　細胞内で運搬される蛋白質には、自身のN末端に荷札となる特徴的なアミノ酸配列が付加された状態で合成され、運搬途中に切断を受けるとの仮説。後に証明され、1999年ノーベル医学生理学賞の受賞につながった。

注2 プロトン駆動力(PMF)
　膜を隔てたプロトンの濃度差に起因する電気化学的ポテンシャル

注3 SPring-8
　兵庫県佐用町に位置する世界最大級の大型放射光施設で、強いX線を用いた実験が可能。

注4 X線結晶構造解析
　蛋白質等の生体高分子の立体構造を明らかにする手段の一つ。構造解析には、解析する分子から構成された結晶を得る必要がある。

注5 AcrB
　細菌に存在し、多くの薬剤排出に関与する膜蛋白質。膜貫通領域は水素イオンを透過させると考えられており、PMFを利用した薬剤排出を行う。

注6 in vitro
　直訳は「試験管内」。細胞からの抽出物等を用いた反応系による実験をさす。

注7 パッチクランプ法
　細胞膜を隔てたイオン等の透過を電気信号として検出する手法の一つ。

注8 変異体解析
　本研究では得られたSecDFの構造情報を基に、重要と推定されたアミノ酸残基を他のアミノ酸に人工的に置換してSecDFの解析を進めた。