大型放射光施設 SPring-8

公開日

2016年03月25日

2016年3月24日
理化学研究所
東京大学
高輝度光科学研究センター
学習院大学

背景
　X線結晶構造解析の発展によってタンパク質の3次元立体構造を原子分解能で決定することが可能となり、タンパク質の機能についての理解が飛躍的に進みました。大型放射光施設「SPring-8^[6]」の明るい放射光^[7]を用いた最先端の結晶構造解析実験では、30µm程度の良質なタンパク質結晶があれば構造を決定することが可能です。しかし、創薬などの研究用途で重要なヒトを含む動物由来のタンパク質の多くは十分な量を入手するのが難しく、30µmの結晶でさえも作製が困難です。また、測定中にタンパク質結晶が放射線損傷^[8]を受け、放射線の影響のない自然な構造の決定が困難であることも大きな問題でした。
　一方で、SACLAが供給するX線レーザーの明るさはSPring-8の10億倍ほどと非常に明るく、わずか数µmのタンパク質結晶で構造を決定できます。SACLAのX線レーザーは明るいだけでなく、発光時間が10fs以下と短いため、放射線損傷が進む前の構造が観察できます。このような特性を活かした構造解析法として「連続フェムト秒結晶構造解析（SFX）法」が開発されました。SFX法では、タンパク質微小結晶を分散させた液体を試料として液体インジェクターと呼ばれる装置から連続的に吐出することで、X線レーザーの照射領域に試料を供給します。SACLAでは最高で毎秒60回のX線レーザーが出射されるので、毎秒60回のペースでデータを連続的に収集することが可能です。しかし、結晶構造を得るために必要な量の試料を用意するには、10～100mgもの結晶が必要です。そのため、大量調製が難しい貴重なタンパク質に対してSFX法を適用することは容易ではありませんでした。また、毎秒60回射出されるX線レーザーに対し液体である試料は連続的に供給されるため、試料中の大部分の結晶にはX線レーザーが照射されず、データ取得ができないという問題もありました。これまでに、試料の量を抑えるための手法として、高粘度流体を用いるインジェクター^[9]や高電圧で液柱を細くするエレクトロスパンマイクロジェット法^[10]などが開発されていますが、どちらも試料は連続的に流れる液体であり、根本的な解決には至っていません。
　そこで、共同研究グループは、SACLAのX線レーザーが照射されるタイミングに合わせて、試料をピンポイントで供給する方法の開発に挑みました。

研究手法と成果
　共同研究グループは、パルス液滴法という、タンパク質微小結晶を含む液滴を空間的・時間的に高い精度で制御する手法を開発しました。これは、正確なタイミング信号と高精度マニピュレーターによってパルス液滴ノズルを制御する手法の確立と、ノズルから吐出された微小液滴（直径0.1mm以下）の挙動を高倍率かつ高速でモニターできる光学システムの構築により実現した手法です。共同研究グループは、SFX法とパルス液滴法とを組み合わせ、サイズ約5µmのリゾチーム結晶を含む試料に波長1.77オングストローム（Å、1Åは100億分の1m）のX線レーザーを毎秒30回照射して結晶構造解析を行いました（図1）。
　30分程度の測定時間で34,322枚の回折イメージを収集し、そのうち4,265枚で良質な回折パターンが認められました。解析の結果、リゾチームの結晶構造を空間分解能2.3Åで決定することに成功しました（図2）。これにより、SACLAのX線レーザーによるSFX法とパルス液滴法を組み合わせることで、0.3mg以下という微量の結晶から構造決定に十分な量のデータを収集できることを実証しました。液体ジェットインジェクターを利用した従来のSFX法では、同様のデータを取得するための試料を用意するために10～100mgの結晶を必要としましたが、パルス液滴法によって必要な結晶の量を従来の数百分の1程度と、劇的に減少させることができました。

今後の期待
　パルス液滴法をSFX法と組み合わせることで、大量調製が困難なタンパク質や他のサンプル導入法では扱うことができなかったタンパク質についても、結晶構造解析が可能になります。また、今回は試料を供給する液滴ノズル径を80µmにしていますが、30 µmにすることで結晶の消費量をさらに1桁減少させることが可能です。解析するタンパク質結晶の特性に適した試料の導入法を実装することで、SACLAはよりユーザーフレンドリーな施設となります。今後、外界からの刺激に反応する受容体、イオンポンプなどの輸送体や、創薬ターゲットとなる膜タンパク質など、さまざまなタンパク質の構造がSACLAにおいて決定されることが期待できます。

【補足説明】
[１] SACLA
理研と高輝度光科学研究センター（JASRI）が共同で建設した日本初のX線自由電子レーザー（XFEL：X-ray Free-Electron Laser）施設。加速器の中で電子の固まりを正確な制御の下で一斉に振動させ、その電子の固まりからX線レーザーを発生させるX線発生装置。2006年度から5年間の計画で建設・整備を進めた国家基幹技術の1つ。2011年3月に完成し、SPring-8 Angstrom Compact free-electron LAser の頭文字を取ってSACLAと命名された。2011年6月に最初のX線レーザーを発振、2012年3月から供用運転が開始され、利用実験が始まっている。大きさが諸外国の同様の施設と比べて数分の1と、コンパクトであるにも関わらず､ 0.1ナノメートル以下という世界最短波長のレーザーの生成能力を有している。詳細はhttp://xfel.riken.jp/

[２] 連続フェムト秒結晶構造解析（SFX）
多数の微結晶を含む液体などをインジェクターと呼ばれる装置から連続的に供給し、フェムト秒のX線レーザーパルスを照射して結晶構造を解析する手法。配向の異なる多数の微小結晶からの回折データを連続的に収集する。SFXは、Serial Femtosecond Crystallographyの略。

[３] 液体ジェットインジェクター
極細ノズルの先端からサンプルを含む液体を噴出させ、X線照射位置にサンプルを送り込む装置。SFX法では、サンプルの微小結晶を連続的に供給するために用いられる。

[４] リゾチーム
多糖類を加水分解する酵素の1つ。本研究で用いたニワトリ卵白リゾチームは129個のアミノ酸残基により構成しており、2個のメチオニン，および8個のシステインを含む。タンパク質のX線結晶構造解析において、リゾチームはモデルタンパク質としてよく用いられる。

[５] 膜タンパク質
生体膜を構成しているタンパク質で、全ゲノムをコードするタンパク質の3分の1を占める。生体膜の表面にあるタンパク質と内部に埋もれたタンパク質がある。生体膜の表面に付着しているものを膜表在性タンパク質、内部に埋もれているものを膜内在性タンパク質と呼ぶ。外界からの刺激に反応する受容体、イオンポンプなどの輸送体など、環境からの刺激を強く受けるタンパク質であるため、創薬の重要なターゲットとされ、高効率な構造・機能解析法の創出が待たれている。

[６] SPring-8
兵庫県播磨科学公園都市にある世界最高の放射光を生み出す理研の大型放射光施設。その運転管理と利用者支援は高輝度光科学研究センター（JASRI）が行っている。SPring-8の名前はSuper Photon ring-8 GeVに由来する。

[７] 放射光
相対論的な荷電粒子（電子や陽電子）が磁場で曲げられるとき、その進行方向に放射される電磁波。放射光は明るく、指向性が高く、また光の偏光特性を自由に変えられるなどの優れた特徴を持つ。

[８] 放射線損傷
X線の持つエネルギーによって、X線と相互作用した分子が壊れること。X線との相互作用で分子が壊れる場合だけでなく、分子が壊れる過程で生じる電子や、壊れた分子から生成する反応性の高い分子が観察対象の分子と化学反応する場合もある。一般的にタンパク質結晶の放射線損傷は、X線と水の相互作用をきっかけに、X線照射後ピコ秒（1ピコ秒は１兆分の1秒）の時間スケールで水から生成する反応性の高い分子がタンパク質と化学反応することで起きる。

[９] 高粘度流体を用いるインジェクター
SFXで利用される結晶供給装置の1つ。脂質、グリースなどの高粘度流体に含まれた微結晶を、ノズル先端から低速で押し出す。サンプルを少量ずつ押し出すことで、使用量を低く抑えることができる。

[１０] エレクトロスパンマイクロジェット法
SFXで利用される結晶供給法の1つ。微結晶を含む液体をキャピラリーに充填して電位を与え、対向電極との間の電位差を利用してキャピラリー先端から引き出す。高い圧力で勢いよくサンプルを噴出させる液体ジェットインジェクターと異なり、サンプルの流量を低く抑えることができる。

【参考図】