大型放射光施設 SPring-8

公開日

2019年09月25日

2019年9月25日
兵庫県立大学
大阪大学

＊研究グループ
伊藤・新澤恭子¹、杉村高志²、御前智則²、蓼原吉輝¹、山本尚吾¹、花田真¹、矢野直峰¹、中川徹也³、上根滋史¹、山田聖³、青山浩⁴、山下栄樹⁵、月原冨武^1,5、吉川信也¹、村本和優¹
1 兵庫県立大学大学院生命理学研究科、2 兵庫県立大学大学院物質理学研究科、3 兵庫県立大学理学部、4 大阪大学大学院薬学研究科、5 大阪大学蛋白質研究所

研究の背景
　ミトコンドリアは生体のエネルギーの産生工場です。その内膜では呼吸鎖複合体I、III、シトクロム酸化酵素へと順次電子が伝達され、シトクロム酸化酵素は我々ヒトを含む多くの生物が取り込んだ酸素（O₂）を水（H₂O）に変換します。これら酵素複合体が触媒する反応によってプロトン（水素イオン）が膜の内側から外側へと汲み出されます。膜を介して蓄積されたプロトンのエネルギーは、複合体Ⅴによる生命活動に必須なアデノシン三リン酸（ATP）の合成に利用されます。

　この呼吸鎖の末端酸化酵素であるシトクロム酸化酵素は、地球上で酸素を利用する生物全てにおいて生理的に非常に重要なタンパク質です。効率的にエネルギーを変換する分子であることから、その反応のしくみを明らかにするため、長年多くの研究が行われてきました。本研究グループでは、シトクロム酸化酵素をウシミトコンドリア膜から単離精製して結晶化することにより、酵素の分子構造を解明してきました。これまで詳細に解析が進められてきた全ての構造は、2個の酵素が会合した2量体と呼ばれるものでした。そのため、シトクロム酸化酵素は生理的に2量体として機能していると信じられてきました。しかし、近年になってミトコンドリア膜中での存在様式を知ることができるようになり、ほとんどのシトクロム酸化酵素は単独の状態（単量体）、又は単量体が複合体I、IIIと会合した超複合体として存在していることが明らかになりました。しかしながら、単量体と2量体とで酵素活性や分子構造を比較することが現在まで不可能だったため、シトクロム酸化酵素が異なる形態をとることの生理的な意義は明らかではありませんでした。

研究の手法と成果
　本研究において、兵庫県立大学大学院生命理学研究科の伊藤・新澤恭子特任准教授（専門分野　生物化学）らは膜タンパク質であるシトクロム酸化酵素を単離精製するため、通常使われていた界面活性剤に代えて、Amphipolと呼ばれる両親媒性のポリマーを用いることにより酵素を単量体と2量体それぞれの状態で安定化させることに成功しました。その結果、単量体と2量体の酵素活性を厳密に比較することができるようになり、単量体の方が高い活性を示すことが明らかになりました。すなわち、単量体は酵素の「活性型」であり、2量体は活性化するための「待機型」である可能性があります。
　単量体化により酵素が活性化するしくみはどうなっているのか、それを分子構造に基づいて理解するためには、単量体酵素を結晶化してその構造を決定する必要があります。しかし、本酵素の結晶化は数十年間にわたって試みられてきたものの、単量体酵素の結晶はこれまで得られていませんでした。膜タンパク質の結晶化においては使用する界面活性剤の選択が鍵となりますが、これまで知られている界面活性剤では酵素は全て2量体として結晶化されてしまいました。そこで、兵庫県立大学大学院物質理学研究科の杉村高志教授（専門分野　有機化学）らが参画し、有機合成の手法により幾種類もの界面活性剤を新規に創りだしました。それらを用いて、伊藤・新澤恭子特任准教授らが結晶化を試みた結果、3-オキサトリデシル-α-D-マンノシド（3OM）という界面活性剤を使うとこれまでとは違って単量体酵素の結晶が得られることが分かりました。

　兵庫県立大学大学院生命理学研究科の村本和優准教授（専門分野　生物物理学）、大阪大学大学院薬学研究科の青山浩准教授（専門分野　構造生物学）、大阪大学蛋白質研究所の山下栄樹准教授（専門分野　蛋白質結晶学）らが大型放射光施設SPring-8を利用してX線結晶解析を行った結果、単量体構造を原子レベル（1.8 Å分解能）で決定することができました。単量体と2量体での酵素活性と分子構造の比較からは、単量体化により酸素を水へ変換するために必要なプロトン（水素イオン）を取り込むための入り口の構造が変化することが明らかになりました。この構造変化によってプロトンの取り込みが促進され、単量体化による酵素の活性化が起きると考えられます。
　また、2量体構造はコール酸分子が結合することによって安定化されていたことから、生体内の環境ではコール酸に類似した生理物質が結合解離することによって、酵素の状態が「待機型」と「活性型」とに変換されると推察されます。さらに、今回の構造解析からは酵素に結合しているカルジオリピンというリン脂質分子は、シトクロム酸化酵素が複合体IとIIIと会合し超複合体を形成するのに関わることも明らかになりました。超複合体の形成は酸素還元反応に必要な電子伝達の効率化や酵素自体の安定化に関わると考えられています。このように、単量体、2量体、超複合体と形態を変化させて活性を制御するしくみは、生体内でのエネルギー生産のバランス制御において重要であると考えられます。