大型放射光施設 SPring-8

公開日

2022年06月14日

2022年6月14日
理化学研究所

背景
　近年、X線を用いた三次元イメージングが高精度化し、幅広い分野で使用されています。特によく使われているのが、X線の吸収や位相でコントラストを付けるX線コンピューター断層撮影法（CT法）^[5]と、散乱でコントラストを付けるコヒーレントX線回折顕微鏡法^[6]の二つです。
　これらの手法では、試料を回転させて測定し、計算によって三次元情報を求めます。大きな試料の三次元情報を求める場合、高い解像度での観察では視野が狭くなり、データをつなぎ合わせる必要があるため、計算が煩雑になります。また、1 cm程度の大きな生体試料中の微小組織に対し、10 nm程度の金などの微粒子標識を導入して観察する際には、コントラストが付きにくいという問題もあります。
　試料を回転させずに断層像を観察する方法として、可視光領域のライトシート顕微鏡（光シート顕微鏡）が開発されています。ライトシート顕微鏡では、シート型の励起光（ライトシート）を試料の横から照射し、ライトシートと直交する方向に試料中の蛍光体分布を観察する顕微鏡システムを設置します。試料をライトシートに対して垂直に並進運動させることで、計算の助けなしに三次元情報を取得できます。蛍光観察を行う顕微鏡のピントが合った面だけにライトシートを照射するため、他の面でのピンボケした像の重なりや、観察面以外での余分な放射線損傷^[7]を避けられます。
　可視光を使った三次元イメージングには、ライトシート顕微鏡のほかに共焦点顕微鏡^[8]と二光子顕微鏡^[9]が開発されていますが、いずれも試料の奥行き方向の解像度が面内方向の解像度よりも劣ることが課題となっています。可視光ライトシート顕微鏡において、奥行き方向の解像度を決めるライトシートの厚みを1マイクロメートル（µm、1 µmは100万分の1メートル）以下にするには、高度な技術が必要となります。一方、面内方向に関しては、200 nm程度の解像度を容易に達成でき、近年の超解像顕微鏡法^[10]の技術を併用すると、さらに改善でき、奥行き方向と面内方向の解像度の非対称性がより際立ち使い勝手が悪くなります。
　そこで国際共同研究グループは、SYNAPSE（Synchrotrons for Neuroscience - an Asia-Pacific Strategic Enterprise）プロジェクトの一環として、ライトシートの厚みが圧倒的に低減されることが期待されるX線領域でのライトシート顕微鏡の開発に取り組みました。

研究手法と成果
　国際共同研究グループは、高解像度の三次元イメージング用のX線ライトシート顕微鏡を、大型放射光施設「SPring-8」の理研ビームラインBL29XUに構築しました（図1a）。構築したX線ライトシート顕微鏡では、全反射ミラー^[11]でX線をシート状に絞ることで、シートの最小厚みが65 nmであることをナイフエッジ測定^[12]で確認しました（図1b、c）。かつ、20倍のレンズの場合、顕微鏡の視野(600 µm角)の縁でも、厚みは300 nm以下でした。また、X線により発光するシンチレーター微粒子を試料中に導入し、広視野で薄い断面の像から、試料の奥行き方向に解像度の高い三次元イメージング計測ができることを示しました。
　今回用いた全反射ミラーは、X線を極限まで小さく集光するのに適し、かつ、色収差（像の色のずれ）がありません。このため、光源からの非常に強いX線を単色化せずに試料に直接当てても、集光サイズ（X線ライトシートの厚み）が小さいままであり、高速での三次元イメージング計測に有利です。国際共同研究グループは、開発したX線領域のライトシート顕微鏡を「MAXWELL（Microscopy by Achromatic X-rays With Emission of Laminar Light）顕微鏡」と名付けました。

　MAXWELL顕微鏡では、X線用の微小蛍光体（サイズ10～20 nmのシンチレーター）を試料内の標識として導入し、ライトシートを当てた非常に薄い断面だけで蛍光を発生させます。その蛍光体の二次元分布をX線光軸に直交する可視光用顕微鏡で観察し、試料をライトシートの厚み方向に移動させながら像を撮影することで、三次元分布を求めます。
　MAXWELL顕微鏡の解像度を調べるため、微細パターン上に20 nm程度の量子ドット^[13]の微粒子を付着させた試料を作製しました。観察の結果、約400 nmの距離に近接する微粒子を解像できることから、面内方向の解像度は400 nm程度であり回折限界に達していることが分かりました（図2a）。また、奥行き方向の解像度は70 nm程度であることが示されました（図2b、c）。これらの結果は、可視光のライトシート顕微鏡（奥行き方向の解像度数百nmから1 µm前後）に比べ、MAXWELL顕微鏡の解像度は奥行き方向では圧倒的に優り、面内でも回折限界程度を達成できていることを示しています。

　MAXWELL顕微鏡を用いた生体試料の三次元観察では、厚さが数十µm程度以上の場合は透明化処理が必要ですが、それよりも薄い場合、透明化処理は不要です。ショウジョウバエの三次元イメージングを行った結果を動画で示します。
https://bit.ly/3tybU8O

今後の期待
　本研究では、70 nm程度の奥行き方向の解像度を持つX線ライトシート顕微鏡の開発に世界で初めて成功しました。面内方向の解像度は回折限界にあたる400 nm程度ですが、今後、超解像顕微鏡法を利用して10倍程度向上させることで、等方的な高解像度三次元イメージングを達成できる見込みです。
　また、低ノイズカメラの使用によって、単分子イメージング実験に必要な性能が得られ、SYNAPSEプロジェクトの主な研究対象となっている脳神経回路網の三次元構造などについて画期的な科学的知見が得られると期待できます。
　励起光として紫外線を使う蛍光顕微鏡技術の開発が世界中で進んでいます。また、近年、シンチレーターをマウスの脳内に導入し、脳組織に損傷を与えずに特定の脳神経機能を操作する新しい光遺伝学法^[14]の確立が報告されています。これらの技術を、今回報告した高解像度の三次元イメージング技術と相補的に用いれば、生命科学、脳科学の分野において有力なツールになると期待できます。

補足説明

※国際共同研究グループ

研究支援
本研究は、RIKEN-MOST（臺灣科技部-日本理化學研究所雙邊合作研究計畫）による支援を受けて行われました。