大型放射光施設 SPring-8

公開日

2023年06月01日

2023年6月1日
理化学研究所
東北大学
科学技術振興機構（JST）

背景
　クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析は、タンパク質溶液を急速凍結した後、電子顕微鏡で撮影し、得られた2次元の分子像からコンピュータでその立体構造を再構成する技術です。試料の結晶化を必要とせず、生理的な環境下に近い水溶液中のタンパク質の詳細な立体構造を明らかにできます。タンパク質のような巨大で複雑な分子の結晶を作ることは難しいため、この技術は大きな注目を集めました。より詳細にタンパク質の構造を明らかにするため、世界中で技術競争が続けられています。研究チームは、これまで干渉性^[5]の高い電子ビームを発生する国産クライオ電子顕微鏡^[6]の利用技術の開発を進め、高い空間分解能を達成したほか、さまざまな成果を得てきました。
　電子線の特徴は、原子の周りのクーロンポテンシャル^[7]（電荷分布）によって散乱されることです。これに対し、X線^[8]は原子核の周りの電子によって散乱されます。この特性の違いにより、電子線では試料の電荷に関する感度が高いことが示されています。これまで、結晶性の無機試料に対しては回折法^[9]を用いて、電荷分布が解析されてきました。最近では、タンパク質や有機化合物の微小結晶の電子回折から機能部位の荷電状態を調べたことも報告されています。結晶性の試料からは比較的高い品質のデータが得られ、高精度のデータが必要とされるこのような解析が可能となってきました。
　一方、単粒子解析で扱う氷中のタンパク質から得られるクライオ電子顕微鏡像は、信号対雑音比^[10]が他の手法に比べて劣ることから、電荷情報の取得は実現していませんでした。また、X線や電子線の散乱から得られる、最も軽い原子である水素原子の信号は非常に弱く、水素原子の可視化は困難です。
　タンパク質中の水素原子や電荷、化学結合の極性などは、構造の安定化に重要な役割を果たすとともに、機能や性質に大きな影響を及ぼします。その分析には、通常の原子の立体配置に加え、これらの情報を取得することが必要です。

研究手法と成果
　研究チームは、理研放射光科学研究センターの高性能国産クライオ電子顕微鏡（CRYO ARM 300）を用いた単粒子解析により、生体内で鉄を貯蔵する役割を持つアポフェリチンというタンパク質の構造を、1.19オングストローム（Å、1Åは100億分の1メートル）という世界最高の空間分解能で構造解析しました（図1）。

　次に、この実験構造データから、構造に基づいて構築した原子配置のモデルのデータを引いた差（差マップ）を計算しました。このようにクライオ電子顕微鏡像やX線回折などの実験データと原子配置のモデルとの差を計算することは、モデルに含まれない基質、薬剤などのリガンド^[11]や、水素原子などの弱い信号を検出するのに有効な手法です。水素原子を持たないモデルを用いると、現れた「正の差」は水素原子に相当し、実験データに由来すると考えられます。
　この差マップから、タンパク質の安定部位におけるほとんどの水素原子が観察できました（図2）。例えば、チロシンというアミノ酸では、全ての水素原子が確認され、側鎖のベンゼン環の先端の水酸基（−OH）の水素原子が近くに存在する酸素原子と水素結合を形成していることも示されました（図2a）。
　アミノ酸の中には類似した構造を持ち、実験データの構造からだけでは区別が難しいものがあります。しかし化学的性質は異なり、タンパク質の機能や構造形成に顕著な影響を及ぼすことがあります。アスパラギンとアスパラギン酸、グルタミンとグルタミン酸がその典型例で、それぞれ両者は側鎖末端のアミノ基（−NH₂）の有無で区別されます。中性のpHで、アスパラギン酸とグルタミン酸は側鎖のカルボキシ基（−COOH）の水素原子が脱離します。今回の測定溶液がpH7.5であったことを反映して、得られた構造のアスパラギン酸とグルタミン酸のカルボキシ基には水素原子はありませんが（図2c、e）、アスパラギンとグルタミンのアミノ基には水素原子が二つ付いているのが確認されました（図2b、d）。これにより類似したアミノ酸でも明瞭に区別がつきます。
　またX線結晶構造解析^[8]では、アスパラギンとグルタミンのアミノ末端（−NH₂）とオキソ末端（>C=O）の同定が特に難しいことが知られていますが、今回のクライオ電子顕微鏡で解析された構造では、水素原子の有無によってアミノ末端とオキソ末端が明確に識別されました（図2b、d）。中性のpHで、アスパラギン酸とグルタミン酸は側鎖のカルボキシ基の水素原子が脱離することで負の電荷（−δ）を持ちます（図2c、e）。

　高分解能^[4]の構造成分（分解能3.0～1.19Åもしくは2.5～1.19Å）を削除し、低分解能成分（分解能100～3.0Å）だけを用いて計算した差マップには、アスパラギン酸とグルタミン酸の側鎖に「負の差」が現れました（図3赤い網目）。 X線は、波長のごく短い光で電気的に中性であるのに対して、電子線は負の電荷を持っています。同じ原子でも電荷を持つものと中性のものでは、散乱のされ方が異なることから、電子線では試料の荷電状態をより高い感度で反映すると考えられます。実際、中性の原子と電荷を持った原子とでは、原子散乱因子^[12]が低分解能領域で大きく異なり、負電荷を持つと電子の散乱因子は減少します（図4）。 そのため、実験データから中性の原子を仮定したモデルを引いた差マップでは負の差が現れると考えられます。一方、電子線照射により試料が損傷を受け構造が消失した場合も負の差となります。前述のアスパラギン酸とグルタミン酸で観測された負の差（図3赤い網目）が電荷に対応することを検証するため、実験データの低分解能領域（分解能100～3.0Å）の構造成分を削除したところ、負の差はほぼ消失しました（図3分解能2.5～1.19Åの構造）。このことは、中性の原子と電荷を持った原子の散乱因子が高分解能領域ではほぼ等しくなることと一致します（図4）。詳細な構造（高分解能成分）は電子線照射損傷をより受けやすいことが知られ、負の差が試料の損傷によるものであれば高分解能成分から計算した差マップに負の差が現れると考えられます。しかし、図3の観察では、反対に、負の差が消失したことから、観測された負の差は負の電荷を表すことが示されました。

　観察結果をさらに補強する実験も行いました。クライオ電子顕微鏡像は、一つの視野に対して非常に短い間隔で連続的に画像を撮影します。電子線照射量が少ない撮影前半のデータのみを使って差マップを計算したところ、電子線照射損傷が増える後半のデータを含んだ場合と、負の差の現れ方にほとんど変化がないことが分かりました。また、負の電荷を与えたモデルにおけるシミュレーション結果とも一致しました。以上から、アスパラギン酸とグルタミン酸で観測された負の差が負電荷に相当することが確認されました。
　化学結合の種類によって極性が異なるため、水素原子と結合相手の原子との距離は異なります。極性の高いアミノ基の窒素原子に結合した水素原子と炭素原子に結合した水素原子で、それぞれの結合相手からの距離を比較したところ、平均値に有意な差が見られました。これは、実測データから得られた構造が化学結合の種類や極性によって水素原子の位置を区別する精度を持つことを示しています。

今後の期待
　本研究では、クライオ電子顕微鏡の単粒子解析を用いて、生理的な環境に近い水溶液中のタンパク質の分解能1.1Å台の構造から、ほとんどの水素原子とアミノ酸側鎖の負電荷を可視化しました。また、この構造が化学結合の種類や極性を区別する精度を持つことも示しました。
　本成果はクライオ電子顕微鏡法の新たな可能性を示すものであり、今回開発した分析手法は化学結合の性質や電荷を解析する強力なツールへとさらなる進化が見込まれます。これらの精密分析技術を通して、生体分子の機能や特性のより深い理解が進み、生命科学の発展や創薬、医療への貢献が期待できます。

補足説明

共同研究グループ

研究支援
　本研究は、科学技術振興機構（JST）未来社会創造事業探索加速型「微小結晶構造の自動・高精度電子線解析（研究代表者：米倉功治、JPMJMI20G5）」、日本医療研究開発機構（AMED）創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業（BINDS）「高分解能単粒子解析、電子線結晶構造解析及びAI測定の高度化と支援（研究代表者：米倉功治、JP22ama121006）」、日本医療研究開発機構（AMED）医療研究開発革新基盤創成事業（CiCLE）などの助成を受けて行われました。