大型放射光施設 SPring-8

公開日

2024年06月14日

2024年6月14日
東京工業大学
理化学研究所

○従来法では構造決定が困難な天然変性タンパク質の構造決定に成功。
○無細胞タンパク質結晶化により、従来より10万分の１のスケールと10分の１の時間で大規模な迅速構造決定に成功。
○がんなどのタンパク質―タンパク質相互作用が関与する疾患に向けた創薬開発に期待。

天然変性タンパク質（IDP）は外部環境に応答し、多様な機能を発揮するタンパク質であり、結合パートナーの分子構造を反映した立体構造変化を示す。IDPの構造を安定化する決定因子を原子レベルで同定することは、IDPの生物学的機能を理解するために重要である。しかし、IDPは柔軟性が高く構造決定が困難であり、構造変化のルールを把握するための十分な構造情報はこれまで蓄積されてこなかった。そこで、研究グループは、IDPのように難易度の高いターゲット分子の構造解析を達成するため、高品質タンパク質結晶のモノマーの一部をターゲット分子に置換した変異体を「組木細工」のように結晶化することで、IDPの重要領域の構造決定を試みた（図1）。当研究グループは、ターゲット分子の足場として高品質ながら迅速かつ小規模な合成が可能な細胞内タンパク質結晶に着目し、これまでに昆虫細胞内で結晶化する細胞内タンパク質結晶「多角体」に固定化した10残基タンパク質CLN025の構造決定に成功している^[1]。さらに、新しい結晶化手法として、無細胞タンパク質発現を用いた迅速なタンパク質結晶化方法を開発し、これを「無細胞タンパク質結晶化（CFPC）法」と名付けた^[2]。CFPC法は、数か月の結晶化スクリーニングを要する従来のin vitro結晶化を劇的に効率化するため、IDPのような難易度の高いターゲット分子の構造決定を実現する結晶設計の最適化スクリーニングへの適用が期待される。

本研究では、「タンパク質組木細工」を用いたIDPの構造解析にCFPC法を取り入れたスクリーニングを導入し、がん治療薬の標的IDPであるc-Mycの構造決定を行なった（図2上）。c-Mycはパートナータンパク質であるMAXと結合してがんを進行させる可能性があり、c-MycとMAXの結合を阻害する分子ががん治療薬の候補となることから、c-Mycの原子レベルの構造情報は重要である。
まず、昆虫細胞内で自律的に結晶を形成する「多角体」を足場結晶とし、モノマーのF12–N29とE70–Y83中の11残基をc-MycのY402–K412（11残基）に置換した、12通りの変異体を設計した（図2下）。これらの変異体モデルをシミュレーションソフトFolditで作成し、算出された自由エネルギーが最も低く安定な分子構造が期待される6種類の変異体を選定した後、CFPC法で合成を試みた。その結果、72時間、30 µLの反応スケールの結晶化反応で5 µmサイズの結晶が得られた。

多角体を足場として固定化したc-MycのX線回折測定を行ったところ、1個の変異体（c-Myc_1/PhC_Δ15–25）で1.92 Åの分解能でc-Mycの構造決定に成功した（図3）。
結晶構造解析の結果、多角体内でのc-Mycは、MAXと複合体をつくる際と同様にαヘリックス構造を形成していることが分かった。c-Mycの構造は5本の疎水性相互作用と2本の水素結合により安定化されており、これらの分子間相互作用がc-Mycのヘリックス構造の固定に重要な因子の候補として絞られた。c-Mycのヘリックスを維持する要因とこれらの結合の重要性を探るために、天然のMAXとの複合体中の構造と詳細な比較を行ったところ、E16IとL19Vの残基間の2ヶ所の疎水性相互作用がc-Mycのαヘリックス構造の維持に必須であることが示唆された（図3）。

その後、得られた結晶構造のコンピュータシミュレーションをもとにc-Mycの周辺環境を変化させた結晶を再設計し、同様の結晶化スクリーニングを4サイクル繰り返した。
最終的に22個の変異体を作製し、うち高分解能の構造解析に成功した8個の結晶構造データをもとに、c-Myc断片をヘリックス構造に固定する重要な分子間相互作用を明らかにした。

●今後の展開
IDPは生物機能の理解や創薬分野での注目度が高いにもかかわらず、長らく構造決定のためのアプローチが限られていたターゲットである。本研究により開発したスクリーニング手法は結合パートナーがまだ同定されていない標的IDPの構造決定にも適用可能である。さらに、迅速スクリーニングによって蓄積された多数の結晶構造は、タンパク質結晶のデザインライブラリーの構築に利用でき、他のタンパク質によって支持されるIDPフォールディング機構の解明が加速されると期待される。

●社会的インパクト
この迅速CFPCシステムは、多様なIDPにおける複雑な構造‐機能関係を明らかにするための新しいアプローチであり、生物学的プロセスにおけるIDPの役割について、基礎科学的な知見を与える強力なツールとなる。また、社会実装としては、「従来の方法では構造が決定できないタンパク質の構造決定、その構造をもとにした薬剤デザイン」や「ハイスループット性を活用したビッグデータ構築による創薬基盤」へ貢献すると期待される。

●付記
本成果は、国立研究開発法人科学技術振興機構「A-step育成型」、「A-step本格型」事業（JPMJTR20U1、JPMJTR224A）、文部科学省科学研究費助成事業（JP19H02830, JP22H00347, JP18H05421, and JP22K19266）、公益財団法人サントリー生命科学財団「SUNBOR SCHOLARSHIP」の支援によるものである。

【用語解説】

【参考文献】