大型放射光施設 SPring-8

公開日

2025年01月17日

2025年1月17日
理化学研究所

理化学研究所（理研）放射光科学研究センター生命系放射光利用システム開発チームの平田邦生専任技師は、大型放射光施設「SPring-8」[1]を活用し、タンパク質のX線結晶構造解析[2]において高い解像度と精度を実現する新たなデータ収集・統合方法を開発しました。 この方法はどのような試料にも適用できるため、タンパク質のメカニズムをより詳細に理解するための基礎研究から創薬応用までの幅広い分野の構造研究に貢献すると期待されます。 生命活動に必須の分子であるタンパク質の立体構造の解明は病気の原因解明や新薬開発に直結します。SPring-8の理研ターゲットタンパクビームライン（BL32XU）では、これまで解析困難だった膜タンパク質[3]の構造解析を次々に実現してきました。 その過程で、同じタンパク質由来のより多くの結晶から得た回折データを多数（数百〜数千データ）統合することで、電子密度図[4]の分解能が向上し、構造解析の精度が大幅に改善されることを発見・確認しました。特に、統合によって回折強度の観測回数を増やすことで細部の構造情報が明瞭化し、高分解能構造解析が可能になることを見いだしました。大量データの統合の際にはデータの品質や構造がばらつく可能性もありますが、事前に機械学習[5]を併用することで結晶の品質や構造が似たデータをグループ化し、少ない工程数でより目的に合ったデータを選定することができるようになりました。 本研究は、科学雑誌『Acta Crystallographica Section D Structural Biology』（1月1日付）に掲載されました。 データ統合数の増加により増え続けるタンパク質の構造情報 論文情報 雑誌名: Acta Crystallographica Section D Structural Biology 題名 :Useful experimental aspects in Small Wedge Synchrotron Crystallography for accurate structure analysis of protein molecule 著者：Kunio Hirata DOI：10.1107/S2059798324011987

タンパク質の機能を理解することは、病気の原因解明や新薬開発に直結する重要なテーマです。その機能を理解するためには、タンパク質の立体構造を明らかにすることが必要となり、タンパク質構造を解明する主要な手法の一つにX線結晶構造解析があります。タンパク質の構造を詳しく見るためには、良質な結晶を50マイクロメートル（μm、1μmは100万分の1メートル）以上に成長させる必要がありますが、放射光ビームライン（研究装置）の技術革新に伴って小さな結晶でも構造解析が可能となりました。SPring-8の放射光ビームラインの一つ、理研ターゲットタンパクビームライン（BL32XU）では、10µm未満の小型結晶でもデータ収集と解析が可能になっています。さらに、X線照射によって結晶が損傷するという根本的な問題に伴う限界を打破するため、複数の結晶から部分的なデータを収集し統合することで、これまで解析困難だった膜タンパク質の構造解明を次々と実現してきました^{注1、2、3）}。平田専任技師はこの経験を通し、統合する結晶数（データ数）が多いほど構造解析の空間分解能が向上する可能性があることに気付き、そのメカニズムと限界点を解明する調査を行いました。

注1）2019年09月26日東京大学プレスリリース「新型の光応答性タンパク質であるヘリオロドプシンの構造を解明」
　　http://www.spring8.or.jp/ja/news_publications/press_release/2019/190926/
注2）2023年4月3日岡山大学プレスリリース「尿路結石形成を防ぐ腸内細菌で働く鍵分子・シュウ酸輸送体の立体構造解明」
　　https://www.okayama-u.ac.jp/tp/release/release_id1074.html
注3）2022年8月25日プレスリリース「細胞膜の中ではたらく特殊なタンパク質分解酵素の構造を解明」
　　https://www.riken.jp/press/2022/20220825_3/

本研究では、3種類のタンパク質の結晶を大量に用いて測定した後、少数の結晶データと多数の結晶データを統合した構造情報を定量的に比較しました。その結果、以下の知見が得られました。
1）分解能向上：より多数の結晶データを統合することで、分解能（電子密度図の解像度）が向上することを確認しました。単なる数値の向上だけでなく、細かい実質的な構造情報が増えていることも証明しました（図1）。このことは、ぼんやりした写真でも同じ画角のものを繰り返し撮像し、その画像を重ねることでより明瞭な画像を得ることができる現象と似ています。
2）構造決定力の改善：統合した結晶数の増加に伴い電子密度図の質が改善され、構造解析（初期構造決定）も容易になりました。
3）データ精度向上の限界：約8,000個もの結晶データを収集し統合しましたが、少なくともこの範囲では分解能向上は限界に到達しませんでした（図1）。特に、非常に観測しづらい微弱な電子密度が統合データ数の増加とともに明瞭に観察できることが分かりました（図2）。

本研究では階層的クラスタリング^[6]などの機械学習を利用して、大量データを結晶間の微妙な構造の違いによってグループ分けした後に統合することの重要性についても検討しました。例えば、大量のデータには不良データが含まれることもあれば、異なる構造のものが混じる場合もあります。それらを構造の似たもの同士でグループ分けすることによって検討すべきデータセットを絞り込み、効率的に構造解析を進めることができます。実際、この方法で低品質のデータグループを排除できました。
これらの結果は、今回発見したデータ収集・統合方法が、大量にデータ収集を行うことで、より解像度の高いタンパク質の構造解析を実現できることを示しており、これはどのような結晶にも適用可能な方法と見られます。

この手法のエッセンスは結晶にX線を照射して得られる回折データを多数収集して統合することです。適用対象は広範にわたる上、実現する分解能の向上は、例えば、タンパク質の機能理解に重要な水素原子の可視化など、タンパク質の機能構造相関を明らかにするための重要な情報取得につながります。
2024年のノーベル化学賞は「コンピュータを用いたタンパク質の構造予測」に対して授与されました。受賞者のデイビッド・ベイカー博士も述べていたようにその受賞の成果には、構造生物学者が長年精度の高い構造解析を積み重ね、その構造情報をタンパク質構造データバンク（Protein Data Bank：PDB）に蓄積・公開し、自由にアクセスできるようにしたことが大きく貢献しました。
そのPDBには、現在、結晶構造解析で決定された190,534構造が登録されており、その平均分解能は2.12オングストローム（Å、1Åは100億分の1メートル）（標準偏差0.59Å）です（2024年12月22日調査）。しかし、タンパク質の構造と機能の関係を深く理解できる水素原子の可視化が期待できる1.5Åより高い分解能で決定された構造は約10％に過ぎません。
本研究でも一部の水素原子が明瞭に見えるようになりました。実験構造解析や予測構造の分解能や精度をさらに大きく向上できれば、水素原子の可視化がもっと簡単にできるようになる可能性があります。この手法により得られる高精度・高分解能の構造データは、タンパク質構造生命科学を次のステージへ進化させる鍵となるでしょう。
大型放射光施設では近年、自動測定・解析技術が進化し測定の効率化が進んでいます。SPring-8で開発した自動データ収集システムZOO^{[7]、注4）}の利用による超効率的データ測定、さらにSPring-8の次世代計画「SPring-8-Ⅱ」による光源性能の向上は、回折データ収集速度の劇的向上と直結しており、これらと本研究の知見・手法を組み合わせることで、次世代のタンパク質の精密構造研究を推進する基盤になると期待されます。本研究は、放射光施設と先端技術のシナジー（相乗効果）を活用し、科学の最前線における新たな発見を支える重要な一歩になると思われます。

注4）2019年2月7日プレスリリース「タンパク質結晶から自動でデータ収集する『ZOOシステム』を開発」
https://www.riken.jp/press/2019/20190207_1/

本研究は、日本学術振興会（JSPS）科学研究費助成事業基盤研究（C）「人工知能を有する自動回折データ収集システムの開発（研究代表者：平田邦生）」、科学技術振興機構（JST）研究成果展開事業研究成果最適展開支援プログラム（A-STEP）産学共同（本格型）「迅速微量多検体構造解析を可能とする無細胞タンパク質結晶化技術の開発（研究責任者：上野隆史）」、日本医療研究開発機構（AMED）生命科学・創薬研究支援基盤事業（BINDS）「創薬等ライフサイエンス研究のための相関構造解析プラットフォームによる支援と高度化（SPring-8/SACLAにおけるタンパク質立体構造解析の支援および高度化）（領域代表：山本雅貴）」による助成を受けて行われました。

【用語解説】