大型放射光施設 SPring-8

公開日

2025年03月12日

2025年3月12日
兵庫県立大学
理化学研究所
名古屋大学

シトクロムP450は、鉄原子を巧みに利用してさまざまな基質の酸化反応を触媒する酵素であり、ステロイドホルモンや胆汁酸の生合成、薬物の代謝など、多くの重要な生物学的プロセスに関与しています。その中でも、長鎖脂肪酸の酸化反応を担うP450BM3は、シトクロムP450ファミリーの中でも顕著に高い活性を持つため、バイオ触媒開発において魅力的な出発点とされています。これまで、P450BM3を改変し、本来の基質でない化合物（非天然基質）を酸化させるためのタンパク質工学的試みが数多く行われてきました。その中で、共同研究グループの荘司教授らは基質誤認識システムを開発し、非天然基質であるスチレンを立体選択的に酸化させることに成功していました（図1）。しかし、P450BM3が非天然基質を酸化する仕組みは未解明でした。反応の仕組みを知るために、反応の途中で現れる「反応中間体」の構造を原子のレベルで観察することが長年望まれてきましたが、反応中間体は非常に不安定であるため、観察は困難でした。

P450BM3は、以下の反応中間体を経て基質酸化を進めることが知られています（図2）。
① 酵素が不活性な状態（酸化型）
② 酵素が電子を受け取り、活性中心に存在する鉄原子を還元した状態（還元型）
③ 鉄原子に酸素分子（O₂）が結合し、スチレンを酸化する準備に入った状態（酸素結合型）
本研究では、基質誤認識システムを用いたP450BM3に特定のアミノ酸を置換することで、反応中間体の安定性を向上させるとともに、スチレン酸化の活性と立体選択性に優れた人工P450BM3を作製しました。この人工P450BM3を用いて、①～③の反応中間体をフリーズトラップし、SACLAを用いた結晶構造解析により、それらの構造を明らかにしました。従来の放射光では、X線照射による反応中間体の崩壊が課題となっていましたが、SACLAが生成する極短パルスX線を用いることで、この課題を克服し、反応中間体が崩壊する前の一瞬の構造を捉えることに成功しました。
詳細な解析の結果、図2に示すように、最初の酸化型に結合したスチレンの向きは不安定でした。しかし、その後、鉄原子が還元され、酸素分子（O₂）が鉄原子に結合する反応が進んでいくと、スチレンは特定の方向から酸化されやすいように「クルっと」回転して一つの向きに揃っていく機構が観測されました。また、スチレンを酵素活性中心へ運び込む通路も消失していました。これまでスチレンの位置や配向を制御する仕組みは不明でしたが、本研究により、鉄原子上で進行する精緻な化学反応が分子全体の構造を制御してスチレンとの反応を進めていることが明らかになりました。

従来、シトクロムP450を基盤としたバイオ触媒開発は、不活性な酸化型の構造に基いて行われることが一般的でした。しかし、本研究で明らかにした反応中間体の構造は、酸化反応における基質の配置や酵素の立体構造が動的に制御されていることを示しています。本研究で発見したP450BM3の触媒サイクル中における基質の配向制御は、スチレン以外の基質や他のシトクロムP450の基質酸化においても存在する可能性があります。本研究で用いられた反応中間体のフリーズトラップとSACLAを組み合わせた構造解析の手法は、これらの反応機構を解明するための強力なツールになります。今後、この手法を活用することで、反応中間体の構造に基づいたバイオ触媒の設計が加速し、新たな触媒機能の創出に繋がることが期待されます。

本研究は、科学技術振興機構（JST）CREST（JPMJCR15P3）、日本学術振興会（JSPS）科学研究費（JP19H05784、JP24H02263、JP18KK0397、JP19K22403）による助成を受けて実施されました。

長尾　聡（兵庫県立大学大学院理学研究科 特任助教（研究当時）／現 高輝度光科学研究センター テニュアトラック研究員）
久保　稔（兵庫県立大学大学院理学研究科 教授）
當舎　武彦（理化学研究所放射光科学研究センター 専任研究員（研究当時）／現 兵庫県立大学大学院理学研究科 教授
杉本　宏（理化学研究所放射光科学研究センター 専任研究員）
荘司　長三（名古屋大学大学院理学研究科 教授）

【用語解説】