取り残されていたToll様受容体の立体構造をついに解析
研究成果 · トピックス
Tollは、ショウジョウバエの発生において背と腹の軸を決定する遺伝子として1985年に発見されました。この遺伝子を発見した研究者が思わず「toll !」（ドイツ語で「すごい」という意味）と叫んだことが、そのまま名前になったそうです。1996年、Toll遺伝子に変異があるショウジョウバエは、カビに感染して死んでしまうことが分かりました。Toll遺伝子には、カビの感染から体を守る機能もあるのです。さらに1997年、Toll遺伝子に似た塩基配列を持つ遺伝子がマウスで見つかりました。その遺伝子からつくられるタンパク質がToll様受容体（以下、TLR）です。「マウスやヒトなど哺乳類のTLRは、病原体から体を守る免疫システムのうち、自然免疫において非常に重要な働きをしていることが分かってきました」と東京大学教授の清水敏之さんは言います。
病原体を認識するセンサー
私たちの周りにはウイルスや微生物などの病原体がたくさんあります。病原体が体内に入ってくると疾患を引き起こします。そうならないために、生物には何重もの防御機構が備わっています（図1）。
まず、病原体を体内に入れないことが重要です。病原体を皮膚で跳ね返し、涙や鼻水で洗い流します。しかし、そうした物理的な防御を擦り抜けてしまうものがいます。そこで働くのが、食細胞やリンパ球などのさまざまな免疫細胞で構成される免疫システムです。病原体が体内に侵入すると、自然免疫が働き出し、マクロファージや樹状細胞などの食細胞が、病原体を捕食します。一方で、樹状細胞は食べた病原体の断片を細胞の外に掲げてリンパ球のT細胞に病原体の情報を伝えます。すると獲得免疫が働き出し、キラーT細胞やB細胞などのリンパ球が特定の病原体を強力に攻撃します。
「自然免疫はあらゆる病原体を攻撃します。だから、食細胞は手当たり次第に病原体を食べているだけだと考えられていました。ところが食細胞は、どんな病原体であるかを認識して自然免疫反応を活性化し、サイトカインというタンパク質を放出して病原体を攻撃していることが分かってきました。病原体を認識する自然免疫の代表的なセンサーがTLRです」と清水さんは説明します。
TLRは1997年に報告されて以来、さまざまな生物で次々と見つかり、ヒトでは10種類が知られています。それぞれ認識するものが異なり、例えば、TLR4はリポ多糖、TLR5は細菌の鞭毛を構成するフラジェリン、TLR3は２本鎖RNA、TLR7とTLR8は１本鎖RNA、TLR9はCpG配列を含むDNA（CpG DNA）を認識します。CpG配列とは、塩基のシトシン（C）とグアニン（G）がホスホジエステル結合でつながったものです。
TLRは細胞膜にあり、外に出ている馬蹄形の細胞外領域と、中にある細胞内領域から構成されます。何も結合していないTLRは分子１個の単量体で存在しています。病原体由来の物質が結合すると、２個の分子が結合した２量体になり活性化します。すると細胞内領域にタンパク質が結合し、「こういう病原体が侵入したぞ」という情報が伝達され、自然免疫の反応が起きるのです（図2）。
「TLRがそれぞれ何を認識するのかが分かってくると、次はそれがTLRとどのように結合し、認識するのかを知りたくなります。そのためには立体構造を詳しく調べることが近道です」と清水さんは解説します。「TLRの立体構造は、2007年くらいから次々と解析されてきました。そうした中で立体構造が不明なまま残されていたのが、TLR7、TLR8、TLR9でした。私たちは、それらの立体構造を明らかにすることを目指しました」
予想外の方法で１本鎖RNAを認識
TLR7～9とTLR3は細胞内のエンドソームという小器官の表面に存在しています。核酸であるRNAやDNAを認識するという共通点もあります。「TLR7〜9のいずれも2000年前後に存在を確認されていながら10年以上も立体構造が解明されず、もう見ることはできないのではないかと諦めムードが漂っていました。ギブアップしたという話は何人もの研究者から聞きました」と清水さん。
そうした中、清水さんたちはついに2013年にTLR8と人工低分子の複合体、続いてTLR8と１本鎖RNAの複合体について立体構造の解析に成功しました。「解析結果を見て、とても驚きました」と清水さん。解析結果を見ると、TLR8に結合しているはずの長い１本鎖RNAが見当たらなかったのです。調べてみると、ウリジンというRNAに特有の物質と、１本鎖RNAが分解してできた短いオリゴヌクレオチドが、TLR8の別の部位に結合していました。「RNAが分かれて２カ所で結合しているとは、誰も考えませんよ」と清水さんは苦笑します。この成果は大きな注目を集めました。
TLR9の構造解析は苦難の連続
そして2015年２月、清水さんたちはTLR9の構造解析にも成功しました。この研究の中心となった准教授の大戸梅治さんは、こう言います。「実は、構造解析を始めたのはTLR8より早かったのですが、苦戦していました。ようやく解析できてホッとしました」
どういう点で苦労したのでしょうか。「X線結晶構造解析を行うには、構造を知りたいタンパク質をたくさんつくり、それがきれいに並んだ大きな結晶をつくらないといけません。ところが、結晶に必要なTLR9のタンパク質をつくれなかったのです」と大戸さん。タンパク質解析を行う場合は普通、そのタンパク質の遺伝子を大腸菌や酵母などに導入してつくらせます。「あらゆる細胞を試しても駄目でした。たまたまタンパク質の発現にはあまり使われないS2というショウジョウバエ由来の細胞を使ってみたら、ようやくTLR9がつくれるようになりました」
これでうまくいくかと思われましたが、ヒトのTLR9は十分な量がつくれませんでした。そこで、サルやウマなど７種類の生物のTLR9を試しました。種によってアミノ酸配列や性質は少しずつ違いますが、CpG DNAを認識するという根本的な機能は同じです。最終的に、ウマとウシとマウスのTLR9について構造解析を行うことにしました。
ところが、TLR9と微生物由来のCpG DNAと反応させても、TLR9が活性化しないのです。「また途方に暮れました」と大戸さん。解決のヒントはTLR8にありました。「TLR8とTLR9にはZループと呼ばれる構造があります。活性化されているTLR8では、そのZループが切れていました。そこでTLR9のZループをあらかじめ切ったら、無事、活性化されました」
こうして、ようやくできたTLR9とCpG DNAの複合体の結晶をSPring-8の構造生物学ビームラインBL41XUで解析しました（図3）。「結晶は100 µm（0.1 mm）と小さく、十分な大きさではなかったのですが、1.6 Åという非常に高い解像度のデータを取ることができました。X線が高輝度で非常に強く、高い平行性を持ったSPring-8でなければ、これほどの高解像度での構造解析は難しかったでしょう」と大戸さんは言います。TLR9とCpG DNAは２対２の比率で結合して、２量体を形成していました。CpG DNAはTLR9の溝にはまり込むことで認識されるというメカニズムも明らかになりました。
TLR9とCpG DNAは２対２の比率で結合して２量体の活性化型を形成する。
CpG DNAはTLR9の溝に結合している。右は、溝の拡大図。
TLR9の機能を抑制するDNA配列（アンタゴニストDNA）とTLR9の複合体の構造解析も行いました。その結果、アンタゴニストDNAとCpG DNAの結合領域は一部重複していて、CpG DNAの結合を邪魔することでTLR9の機能を抑制していることが分かりました。なぜ抑制についても調べたのでしょうか。「免疫は活性化した方がいいと思われがちですが、過剰な活性化は自分を攻撃してしまう自己免疫疾患を引き起こします。免疫は活性化と抑制のバランスが重要で、抑制メカニズムの理解も欠かせません」と清水さんは指摘します。
清水さんたちは、すでに次の目標に向かって動き出しています。「まずは残っているTLR7を片付けてしまいたいですね」と大戸さん。清水さんは、「TLRについては、細胞外領域と細胞内領域が結合した状態での構造解析はまだできていません。それをぜひやりたいです」と意気込みます。そして「私たちは薬学系に所属していますから、創薬に結び付けることも常に意識しています」とも語ります。TLR8やTLR9の構造解析から得られた知見は、抗ウイルス薬やアレルギー薬、ワクチンなどの開発につながると期待されています。
諦めなかった理由
TLR8やTLR9の構造解析は、水面下で激しい競争が繰り広げられていました。「先を越されたらどうしようと、毎日ドキドキしていました」と清水さん。脱落していくライバルもいる中、なぜ諦めずに続けたのでしょうか。「せっかく始めたのだから、絶対に構造を見てやろうという意地ですね」と大戸さんは笑います。「誰も見ていないものを見るってワクワクするでしょう。どんな形をしているのか見たい。その一言に尽きます」と語る清水さんは、実は有機化学をやりたかったそうです。「化学実験の才能がなくて諦めました。構造生物学に進み、初めて解析したタンパク質の形がとても美しかった。それで、この世界にはまってしまいました」
構造生物学に向いているのはどういう人かと聞くと、「粘り強い人」と声が揃いました。とはいえ、煮詰まることもあります。走ることで気分転換し、学生時代からのブランクを破ってフルマラソンへの挑戦を密かに狙っている大戸さん。愛犬との散歩でリフレッシュしているという清水さん。次は、どんなタンパク質の形を見せてくれるのでしょうか。
研究室にて。清水さん（左）と大戸さん（右）
文：フォトンクリエイト 鈴木 志乃
この記事は、東京大学大学院薬学系研究科蛋白構造生物学教室の清水敏之教授と、大戸梅治准教授にインタビューして構成しました。